草甘膦N-乙酰转移酶反应动力学研究.pdfVIP

第26卷第6期 华 中 农 业 大 学 学 报 Vo1．26 No．6 2007年 12月 Journal of Huazhong Agricultural University Dec．2007，8O5～8O8 草甘膦N．乙酰转移酶反应动力学研究 卢维维 洪玉枝 刘子铎一 (华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉430070) 摘要 草甘膦 乙酰转移酶(glyphosate N-acetytransferase，GAT)是一种能够通过转乙酰基的反应将草甘 膦代i射为低毒物质乙酰草甘膦的酶，在抗除草剂转基因作物中具有潜在的应用价值。通过将地衣芽孢杆菌Ba— cillus licheniformis(Weigmann)Chester AB 94036中的草甘膦N-乙酰转移酶(glyphosate N-acetyltransferase， GAT)基因克隆到大肠杆菌中，获得含有重组质粒pGEX 6p-l-gat的重组菌株。对重组菌株进行诱导表达，经过 GST亲和层析纯化，获得约17 ku的目的蛋白。通过酶标仪和连续分光光度分析法，对GAT蛋白进行了酶反应 动力学测定。研究表明GAT的催化常数忌 为6．420 min～，米氏常数K 为l|162 mmol／L，由此得出其催化效 率忌 ／gM为5．52 L／(mmot·min)。 关键词 草甘膦N-乙酰转移酶；亲和层析；连续分光光度分析法；酶反应动力学 中图法分类号 Q 555 ．3 文献标识码 A 文章编号 1000—2421(2O07)O6一O8O5一O4 草甘膦(N—phosphonomethyl—glycine，glypho— 形成很好的蛋白晶体，所以KEENAN等E∞]通过x射 sate)是一种广谱灭生性、内吸传导型的除草剂，它 线衍射的方法，分析了突变GAT蛋白的晶体，得到了 对大多数的植物和许多微生物都有很高的毒性，对 突变蛋白的三维结构。通过对改组的GAT酶的结构 人畜低毒、低残留，有很高的商业价值，在全世界范 和功能的分析，DANIEL等发现Ar 21，Ar 73， 围内得到了广泛使用l】 ]。但是由于草甘膦是一种 111和Hi~138 GAT的4个活性氨基酸残基位点，它 非选择性的除草剂，在除去杂草的同时，也会杀死农 们贡献出正电荷，供底物草甘膦分子结合，这是几个 作物，这就限制了其使用范围 。正是因为如此，得 相对保守的位点，其中Hi~138行使着转乙酰的催化 到草甘膦抗性的农作物，对农业生产和草甘膦工业 功能u 。 都有促进作用。 本研究从地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis 草甘膦的毒性机理主要是竞争性抑制草莽酸合 (Weigmann)Chester AB 94036中克隆出草甘膦N一 成途径中的5一烯醇丙酮草莽酸一3一磷酸合成酶(EP— 乙酰转移酶基因，将表达纯化后获得的纯GAT酶 SP合成酶)，它是微生物和植物体中芳香氨基酸生 通过连续分光光度分析法，对其酶反应动力学进行 物合成的一个关键酶E _5_。草甘膦的抑制作用，阻断 了研究。 了分枝酸的合成，使之无法进一步合成芳香氨基酸， 1 材料与方法 扰乱了生物体的正常代谢过程[6 ]。CASTLE等通 过质谱的方法，从地衣芽孢杆菌中找到了1个基因， 1．1 材 料 它编码草甘膦 N．乙酰转移酶(GAT)，这个酶催化 1)菌株与质粒。大肠杆菌E．coli DH5a、表达 转乙酰基的反应，将草甘膦代谢成低毒物质。他们 载体pGEX 6p一1由华中农业大学农业微生物学国 通过11轮的DNA改组技术(DNA shuffling)，大幅 家重点实验室生物分子工程研究室保存，B。lichen— 度增加了草甘膦N一乙酰基转移酶 (GAT)的酶活， iformis(Weigmann)Chester AB 94036来自中国典 对草甘磷的抗性提高了4 500倍。改组后的酶无论 型培养物保藏中心。 是在大肠杆菌中还是在植物中，对草甘磷的耐受性 2)试剂。限制性内切