生物技术 第二章 载体(2学时).ppt

第二节 基因工程载体 一般特征 质粒是染色体外能够自主复制的双链闭合环状DNA分子。 广泛存在于细菌中，某些蓝藻、绿藻和真菌细胞中也存在质粒。 它是一种裸露的比病毒更简单，有自主复制能力的DNA分子。 基因组长度：约为50kb的双链DNA分子，实际大小为48502bp。 DNA是线状双链分子带有单链的互补末端，末端长12个核苷酸，称为粘性末端，简写cos，12个碱基的序列为5-GGGCGGCGACCT-3。当噬菌体感染宿主细胞后，双链DNA分子通过cos而成环状。 中央片段，12kb～24kb，含PL控制red和gam基因。 λ噬菌体克隆载体的构建策略 ⑵ λ噬菌体载体的类型 两种类型： ①置换型 ②插入型 三、柯斯质粒 1978年Collins和Hohn构建一种新型的大肠杆菌克隆载体，命名为cosmid(柯斯质粒)，又叫粘粒。 柯斯质粒（cosmid）= cos序列+质粒。 实际是质粒的衍生物，它是用正常的质粒同λ噬菌体的cos位点构成。 (四)酵母载体(yeast vector)：略 酵母人工染色体(yeast artificial chromosome, YAC)：可接受2Mb的外源DNA插入，是人类基因组计划物理图谱绘制采用的主要载体 PUC质粒作为基因克隆载体应有下列何种调控元件 ( A B C D ) A.AmPr B.ori复制子 C.LacZ标记 D.多克隆位点 在含某个基因的载体中，将目的基因DNA片段插入该基因，导致该基因的功能失活如：抗性基因的插入失活筛选，含Tetr和Ampr基因的载体，若将目的基因插入Tetr基因，导致Tetr基因失活，形成重组质粒Tets和Amps 下列关于染色体和质粒的叙述，正确的是：（ C ） A．染色体只存在于真核生物细胞中，质粒只存在于原核生物细胞中 B．在基因工程中染色体和质粒均可以作为运载体 C．染色体和质粒均与生物的遗传有关 D．染色体和质粒的化学本质相同 10.某一质粒载体具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因内有一Bgl I的切点。现用Bgl I切割该载体进行基因克隆，问：(1)转化后涂皿时应加什么样的抗生素? (2)培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型? (3)如何利用抗性变化筛选到含有插入片段的重组体?（6分） （1）Tetr（2分）; （2）Tetr and Kans（２分）；（3）在含有Tet和Kan中不能生长的重组子，却能在仅含有Tet的生长的为理想的重组子（２分）。 天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？ （1） 载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。 （2） 载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。 （3） 载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。 （4） 载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。 （5） 载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。 自然界中具备理想条件的质粒载体为数不多，即使是ColEl和pSCl01这两个自然质粒也不尽人意，通常需要进行改造，请问质粒改造包括哪些基本内容? *由?DNA的Cos区与质粒构建,即质粒DNA接上λ噬菌体粘性末端(cos,cohesive ). *环状双链DNA，结合质粒克隆载体和λ噬菌体克隆载体的优点． ◆具有λ噬菌体 粘性末端特性，带Cos区，可进行体外包装 ◆具有质粒耐药性标记如Amp?，Tet? ◆具有多个限制性酶切位点 ◆具有高容量的克隆能力 ◆接上真核细胞复制子和启动子及选择标记，就能在真核细 胞中存在和表达． 特点： 与 ? 噬菌体载体不同的是，外源片段克隆在粘粒载体中是以大肠杆菌菌落的形式表现出来的，而不是噬菌斑。这样所得到的菌落的总和就构成了基因文库。???? ? （五）病毒载体(virus vector):略 作用：在真核细胞或者哺乳动物细胞中表达外源基因。 种类： 昆虫杆状病毒载体（真核细胞表达常用）； SV40病毒载体； 逆转录病毒载体（转基因常用）； 腺病毒载体（稳定表达）； 痘苗病毒载体等。 Ti质粒为根癌农杆菌核外的一种环状双链DNA分子，长约200Kb。其中含有一段称为T-DNA的可转移区段，当农杆菌侵染寄主细胞后，T-DNA可以从农杆菌转移到寄主细胞内并整合到寄主细胞的基因组中。Ti质粒的这一特性为农杆菌介导法植