第四章 植物细胞培养方法(修改).pptVIP

第四章　植物细胞培养方法 杨柏云 南昌大学生命科学学院 一.概述 1、细胞培养技术的概念： 是指在人工控制条件下，高密度地培养有用细胞的技术。 2、细胞培养技术的目的： 增殖由基因重组、细胞融合、细胞突变等获得的新型有用细胞。 生产人类必需的、不可缺少的有用物质，如药物和工业原料等。 一.概述 3、植物细胞培养技术的优点 （1）可控制条件下生产有价值次级代谢产物； （2）细胞增殖速度快； （3）生产力不受自然条件的影响； （4）产品的产量和质量稳定，并具生产灵活性； （5）可进行特定的生物转化反应，即把各中初级化合物转化成医药等更有效的化合物。 一.概述 例如：两种不同方式生产紫草宁的比较 　　　　　收获时间　紫草宁浓度（％干重） 完整植株　　2～3年　　　1～2 植物细胞培养　3周　　　　14 一.概述 4. 与微生物相比，植物细胞具有的特性 细胞大，细胞壁以纤维素为主要成分，耐拉不耐扭，抗剪切能力低； 生长速率慢，为防止培养过程中染菌，需加抗生素； 细胞培养需氧，而培养液粘度大，且不能强力通风搅拌； 产物在细胞内且产量低； 细胞常生长成各种大小的团块，增加了悬浮培养的难度等。 一.概述 5. 植物细胞培养的培养基 定义：含有一定营养成分，供组织培养植物生长的基质 无机营养成分：C，H，O大量元素及部分微量元素 有机营养成分 ① 含N物质：包括维生素和氨基酸 ② 碳源：2%—5%的蔗糖 ③ 琼脂：起支持作用 ④ 生长激素：生长素，细胞分裂素和赤霉素 PH值：5.0－6.0 二.单细胞培养技术 (一)植物单细胞培养的意义 1、有利于获得纯细胞系，悬浮培养细胞间细胞间在遗传、生理和生化上存在差异，这些差异反映在它们的产量、品质、抗病虫性和抗逆性等方面。如果能将高抗、高产、高品质的细胞株筛选出来，无疑会带来巨大的经济效益。 2、有利于排除体细胞的干扰，进行细胞特性、细胞生长规律、细胞代谢过程及其调节控制规律等方面的研究； 3、有利于对细胞活动跟踪观察，观察细胞个体的分裂、分化、生长和繁殖情况； 4.有利于生物转化和天然化合物的生产。  二.单细胞培养技术 (二)植物细胞的获取 1.从外植体直接分离植物细胞 外植体经过切割、捣碎或酶解，然后经过一定孔径的不锈钢筛网过滤，得到细胞悬浮液。悬浮液中所含的完整细胞数量较少，但分散性好。 要直接从植物器官中分离单细胞，通常采用机械法和酶解法。 叶片是由从外植体分离单细胞的最好材料 (1)机械法： 第一种方法：用刀片刮叶片； 第二种方法：先把叶片轻轻研碎； 上述二种方法，都要通过过滤和离心净化细胞。 二.单细胞培养技术 (2)酶解法： 分离细胞是利用果胶酶、纤维素酶处理，分离出具有代谢活性的细胞，该法不仅能降解中胶层，而且还能软化细胞壁。所以在用酶解法分解细胞的时候，必须对细胞给予渗透压保护。常用的渗透压保护剂是甘露醇。 二.单细胞培养技术 ③机械法和酶解法比较 机械法：细胞不受到酶的伤害；不用质壁分离，有利于进行生理和生化研究 ；容易伤害细胞结构，获得完整细胞团或细胞数量极低 ；细胞易破。 酶解法：细胞受到酶的伤害；要质壁分离；细胞产量高；细胞不易破。 二.单细胞培养技术 2.由组织培养分离单细胞 步骤： ①诱导产生愈伤组织； ②愈伤组织反复继代，使组织不断增　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　殖，提高愈伤组织的松散性。 ③将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养系。 二.单细胞培养技术 ?在植物的组织培养中，从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：启动期、分裂期和形成期。 　启动期是指细胞准备进行分裂的时期。外源植物生长素对诱导细胞开始分裂效果很好。 常用的有：2,4－D、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）等。通常使用细胞分裂素和生长素比例在1:l或是小于1来诱导植物愈伤组织的形成。 二.单细胞培养技术 分裂期是指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。分裂期愈伤组织的特点是：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。 分化期是指在分裂的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。这些细胞类型有薄壁细胞、分生细胞、色素细胞、纤维细胞等等。 二.单细胞培养技术 外植体的细胞经过启动、分裂和分化等一系列变化，形成了无序结构的愈伤组织。如果在原来的培养基上继续培养愈伤组织，会由于培养基中营养不足或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。如果要让愈伤组织继续生长增殖，必须定期地（2～4个星期）将它们分成小块“接种到新鲜的培养基上，这样愈伤组织就可以长期保持旺盛的生长。这个过程就叫继代培养。  常用的外植体及接种方