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酵母双杂交系统及应用 　　摘要：通过对蛋白质间相互作用的研究可以更好地理解生命的本质，而酵母双杂交系统是体内分析蛋白质间相互作用的一种遗传学方法，本文对此系统的原理、优点、局限性和改进及应用进行了介绍。 　　Abstract: Through research on protein interactions we can better understand the essence of life, and yeast two-hybrid system in vivo analysis of protein interactions is a genetic approach. In the paper, advantages, limitations and improvement and applications the principle of this system are introduced. 　　关键词：酵母双杂交；蛋白间相互作用 　　Key words: yeast two-hybrid；protein interactions 　　中图分类号：G31 文献标识码：A 文章编号：1006-4311（2011）23-0321-02 　　0引言 　　随着分子生物学的发展，人们对生命的研究逐渐从基因组时代转到后基因组时代。蛋白质间相互作用的研究是后基因组时代的重要组成部分，对蛋白质相互作用的认识可以更好地理解生命的本质，众所周知蛋白质在细胞生命活动过程中起着非常关键的作用。酵母双杂交系统是体内分析蛋白质间相互作用的一种有效的遗传学方法，而过去也有许多方法用来研究蛋白质间的相互作用，但都是体外研究方法如交联、免疫共沉淀、亲和层析等，这些方法容易受外界条件的影响，还需要纯化蛋白，同时要求蛋白质间存在比较强的作用力，而酵母双杂交系统操作是在核酸水平上进行，是在酵母细胞内研究蛋白质间的相互作用，并且还能检测到蛋白质间微弱的相互作用，无需对蛋白质进行纯化，因此自从该技术建立以后，得到了迅速广泛的应用。 　　1酵母双杂交系统的原理 　　酵母双杂交系统由Fields和Song[12]等于1989年首先在研究真核基因转录调控中建立，此系统是在酿酒酵母体内分析蛋白质间的相互作用。真核生物转录调控过程的认识为酵母双杂交系统的建立奠定了基础，其理论依据为典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4等都含有两个可分离的结构域：DNA结合结构域（DNA-binding domain，简称为DB）和转录激活结构域（transcription-activation domain，简称为AD），前者负责识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，后者与转录复合体的其他成分作用，启动所调节基因的转录，这两个结构域结构上相互独立但功能上又相互依赖，一个完整的转录因子必须同时含有这两个结构域，否则将无法完成转录激活功能。酵母双杂交是将BD的核酸序列与诱饵蛋白X的核酸序列结合构建成BD-X融合表达载体，X往往是已知蛋白，将AD的核酸序列与猎物蛋白Y的核酸序列结合到一起构建成AD-Y表达载体，之后将这两个质粒共同转入同一酵母细胞内表达，如果X和Y之间存在相互作用，那么与他们分别融合的BD和AD在空间上就能充分接近，呈现出完整的转录因子活性并激活相应报告基因的表达，而单独的BD和AD均不能激活报告基因。通过检测报告基因表达与否，就可以很容易地判断出X和Y之间是否存在相互作用，当把Y变成基因文库或cDNA文库时，就可以直接从文库中找到与X相互作用的蛋白的DNA序列。 　　2酵母双杂交系统的特点和优点 　　酵母双杂交系统与其它研究蛋白质间相互作用的方法相比其主要表现在[5,14]：①发现和研究在活细胞体内的蛋白质间的相互作用，转录因子功能是在融合基因表达后，在细胞内重新组建转录因子之后发挥作用的，不需要分离纯化蛋白质，这就避免了在提纯蛋白过程中可能引起蛋白变性，因此保持了蛋白的生物活性，能更真实地反映体内相互作用的真实情况。②可以直接从文库中获得相互作用蛋白的核酸序列。③能敏锐地通过报告基因检测到蛋白间微弱的、瞬间的作用，是一种研究蛋白间相互作用非常灵敏的技术。④酵母双杂交系统可采用不同组织器官细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质。⑤常用酵母细胞作为报道株，具有直接进行选择的标记基因，易于转化、便于回收扩增质粒，同时酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合等特点和优点。 　　3常见问题及改进 　　酵母双杂交系统是分析蛋白质间相互作用的一种非常有效的方法，自从建立以来，得到广泛的应用，但仍存在一些局限性，容易出现假阳性和假阴性，而且对蛋白质在细胞中的定位有非常严格地要求，同