水产微生物实验—细菌特殊构造的染色法及活细菌运动性的观察.docVIP

实验六　细菌特殊构造的染色法及活细菌运动性的观察 一、基础知识 荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质，其成分为多糖、糖蛋白或多肽。由于荚膜与染料的亲和力弱、不易着色；而且可溶于水，易在用水冲洗时被除去。所以通常用衬托染色法染色，使菌体和背景着色，而荚膜不着色，在菌体周围形成一透明圈。由于荚膜含水量高，制片时通常不用热固定，以免变形影响观察。实验中介绍3种荚膜染色法，其中湿墨水法较简便、并适用于各种有荚膜的细菌。 芽孢又叫内生孢子，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。 由于芽孢壁厚、透性低、不易着色，当用石炭酸复红、结晶紫等进行单染色时，菌体和芽孢囊着色，而芽孢囊内的芽孢不着色或仅显很淡的颜色，游离的芽孢呈淡红或淡蓝紫色的圆或椭圆形的圈。为了使芽孢着色便于观察，可用芽孢染色法。 芽孢染色法的基本原理是：用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进人菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。 鞭毛是细菌的运动“器官”细菌是否具有鞭毛，以及鞭毛着生的位置和数目是细菌的一项重要形态特征。细菌的鞭毛很纤细，其直径通常为0.01—0.021xm，所以，除了很少数能形成鞭毛束(由许多根鞭毛构成)的细菌可以用相差显微镜直接观察到鞭毛束的存在外，一般细菌的鞭毛均不能用光学显微镜直接观察到，而只能用电子显微镜观察。要用普通光学显微镜观察细菌的鞭毛，必须用鞭毛染色法。 鞭毛染色的基本原理，是在染色前先用媒染剂处理，使它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。鞭毛染色方法很多，本实验介绍硝酸银染色法和改良的Leifson氏染色法，前一种方法更容易掌握，但染色剂配制后保存期较短。 在显微镜下观察细菌的运动性，也可以初步判断细菌是否有鞭毛。细菌运动性的观察可用压滴法和悬滴法。观察时，要适当减弱光强度以增加反差，若光线太强，细菌和周围的液体难以区分。 二、实验目的 1．掌握荚膜、芽胞、鞭毛染色的原理和操作技术 2．观察细菌鞭毛的形态特征 3．初步了解芽孢杆菌的形态特征 4．学习用压滴法和悬滴法观察细菌的运动性。 三、实验材料 褐球圆属菌（Azotobacter Chroococcus）或胶质芽孢杆菌（B.macilagimosus）约2d元素培养其琼脂斜面培养物；蜡样芽孢杆菌约2d营养琼脂斜面培养物，球形芽孢杆菌（B.sphaericus）1-2d营养琼脂斜面培养物，苏云金芽孢杆菌（B.thurngiensis），假单孢菌（Pseudononas.sp），金黄色葡萄球菌。 四、实验器材、试剂 1．器材：载玻片、盖玻片、滤纸、显微镜、大试管、滴管、烧杯、试管架、载玻片、木夹子、凹载玻片。 2．试剂：绘图墨水，上海墨水厂的“泸水绘图墨水”效果较好，必要时用滤纸过滤后使用，10%甲基紫水溶液，10%结晶紫水溶液，6%葡萄糖水溶液，20%硫酸铜水溶液、甲醇，5%硫酸铜水溶液，0.5%番江水溶液、硝酸银鞭毛淡色液，Leifson氏鞭毛染色液，0.01%芙蓝水溶液，无菌水，凡士林。 五、实验操作 （一）荚膜染色法 湿墨汁法：加一滴墨法于洁净的玻片上，并挑取少量菌与其充分混合，加盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸收多余菌液。镜检时，背景、灰色、菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜，用低倍镜和高倍镜观察，若用相差显微镜观察，效果更好。 注：墨法最好用“沪光”绘图墨汁，用滤纸过滤后贮于瓶中备用。加盖玻片时勿留气泡，以免影响观察。 干墨汁法： 1．制菌液：加一滴6%葡萄糖液于洁净玻皮一端，挑取少量培养了72小时的圆褐固氮菌或被检菌充分混合，再加一杯墨汁，混匀。玻片必须洁净无油渣，否则涂片时混合液不能均匀散开。 2．制片：左手执玻片，右手拿中一光滑的载玻片（推片），将推片一端边缘置于菌液前方，然后稍向后拉，当与菌液接触后，轻轻地和左右移动，使菌液沿推片接触后缘散开，然后以30度角，迅速而均匀地将菌液推向玻片另一端，使菌液涂成一薄膜。 3．干燥：空气中自然干燥。 4．固定：用甲醇固定1分钟，立即倾去甲醇。 5．干燥：在酒精灯上方、文火干燥。 6．染色：用1%甲基紫水溶液染1-2分钟，水轻洗，自然干燥。 7．镜检：菌体紫色，背景灰色，荚膜呈一清晰透明图。 （二）芽孢染色法 1.制片：按常规涂片、干燥、固定。 2.染色：加数滴孔雀绿染液于涂片上，用木夹夹住载玻片一端，在微火上加热至染料冒蒸气并开始计时，维持5min。