水产微生物实验—细菌的生理生化反应.docVIP

实验九 细菌的生理生化反应 一、基础知识 糖发酵试验 糖发酵试验是最常用的生化反应，在肠道细菌的鉴定上及酿造工业中鉴别培养酵母和野生酵母的一种重要方法。绝大多数微生物能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖并产酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和气体(如氢、甲烷、二氧化碳等)；有些细菌只产酸不产气。如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气，伤寒杆菌能分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。酵母菌能分解葡萄糖、蔗糖生成乙醇和CO2，不能分解乳糖。 酸的产生可利用指示剂来判断，在配制培养基时，预先加入溴甲酚紫(pH5.2呈黄色，pH6.8呈紫色)，当发酵变酸时可使培养基由紫色变为黄色。气体的产生可由发酵管中倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。若试管中培养液呈黄色则表示培养液为酸性，如倒置的德汉氏小试管中无液体则培养中已产气，拔开棉塞嗅闻有酒味者已产生乙醇。 吲哚试验 有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨种的色氨酸产生吲哚。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，就会形成红色的玫瑰吲哚。大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌阴性。 甲基红(M.R试验) 某些细菌(如大肠杆菌、志贺氏菌、产气杆菌等)在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再进一步分解为乙酸、乳酸、琥珀酸等。酸类增加愈多，则使培养基中的pH值愈下降，当降至pH4.5以下时，指示剂甲基红则呈红色，即为阳性反应。如pH值高于4.5时则指示剂呈黄色，即为阴性反应。因此，在培养物中加入1滴甲基红试剂，立即可以观察到上述结果之一。大肠杆菌为阳性反应，产气肠杆菌为阴性反应。 乙酰甲基甲醇试验(V-P反应) 某些细菌（如产气杆菌）在糖代谢过程中，利用葡萄糖．产生丙酮酸，再将丙酮酸缩合。脱羧而成为中性的乙酰甲基甲醇，该物质在碱性条件下能被空气中的氧气氧化生成二乙酰。二乙酰能与培养基中含胍基的化合物发生反应，立刻或于数分钟内生成红色化合物；即为V-P试验阳性；没有红色化合物则为阴性。产气肠杆菌V-P反应阳性，大肠杆菌V-P反应阴性。 柠檬酸盐试验 有些细菌能利用柠檬酸钠作为碳源，例如产气肠杆菌；而另一些细菌不能利用柠檬酸钠，例如大肠杆菌。细菌在分解柠檬酸盐及培养基中的磷酸铵后，产生碱性化合物，使培养基的pH升高，在有1%溴麝香草酚蓝指示剂的情况下，培养基由绿色变为深兰色。溴麝香草酚蓝的指示范围为：pH小于6.0时呈黄色，pH在6.0—7.6时为绿色，pH大于7.6时呈兰色。 硫化氢试验 有些细菌能分解含硫的有机物，如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等产生硫化氢，硫化氢遇培养基中的铅盐或铁盐等，则形成黑色的硫化铅或硫化铁的沉淀物，从而可确定硫化氢的产生。大肠杆菌为阴性，产气肠杆菌为阳性。 二、实验目的 1．学习糖发酵试验方法。 2．了解糖发酵的原理和在微生物分类鉴定中的重要作用。 3．学习吲哚试验、甲基红试验、乙酰甲基甲醇试验、柠檬酸盐试验和硫化氢试验的操作方法。 4．了解吲哚试验、甲基红试验、乙酰甲基甲醇试验、柠檬酸盐试验和硫化氢试验在微生物研究工作中的作用。 三、实验器材 1．器材：接种环、酒精灯、试管架、蜡笔、标签、空试管、恒温培养箱。 2．培养基和试剂：分别装有乳糖发酵液，葡萄糖发酵液，蔗糖发酵液的试管(内装有倒置的德汉氏小管)若干支，葡萄糖蛋白胨水液体培养基8管(灭菌备用)，柠檬酸盐斜面培养基，柠檬酸铁铵高层培养基，甲基红试剂，肌酸，40%KOH液，6%α-萘酚酒精溶液，40%KOH，乙醚，吲哚试剂等。 3．菌种：大肠杆菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌、啤酒酵母。 四、实验步骤 （一）糖发酵试验 1．配置乳糖发酵液，葡萄糖发酵液，蔗糖发酵液培养基。 2．取3种糖发酵液各2支，以无菌操作法用接种环往每1支试管中各接种大肠杆菌2环，贴好标签，并且每种糖发酵液另各留1管不接菌作空白对照。 3．用同法分别接种普通变形杆菌或啤酒酵母菌，均对应贴好标签(注明菌名、糖液名称)。 4．接种后放试管架上置37℃温箱中培养24h。观察结果。 5．试验结果填入下表：用“+”表示产酸产气；“+”表示产酸不产气；“一”表示不产酸不产气；“++”表示产气产乙醇；“―”表示不产乙醇不产气。 菌种 糖类发酵液 大肠杆菌 普通变形杆菌 啤酒酵母菌 对照 乳糖发酵液 葡萄糖发酵液 蔗糖发酵液 （二）吲哚试验、甲基红试验、乙酰甲基甲醇试验、柠檬酸盐试验和硫化氢试验 1．接种：用接种针将大肠杆菌、产气肠杆菌分别穿刺接入2支柠檬酸铁铵高层培养基、2支蛋白胨水培养基（做吲哚试验）、2支葡萄糖蛋白胨水培养基（做甲基红试验与V-P试验）和2支柠檬酸盐斜面培养基中。 2．培养：于37℃恒温箱中培养2天后取出。 3．从恒温箱中取出柠檬酸铁铵高