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流 式 细 胞 仪 补 偿 设 置 众所周知 流式细胞是通过内置的激光器发射的激光激发荧光染料 通过荧光将488nm 或其他波长的光转变为另一波长的光 并通过光电倍增管将光信号转变为电信号 并由计算 机统计处理变为可读数据 现在流式细胞上常用的荧光素有 激发波长 发射波长 FITC 488nm 525nm PE 488nm 575nm PE-TR 488nm 615nm PE-Cy5.5 488nm 667nm PE-Cy7 488nm 767nm 以上五种荧光染料可在Coulter XL 或BD Calibur 或Partec,PAS,Cyflow Cytomation,Moflo 机型上使用 APC 633nm 660nm APC-Cy 633nm 767nm ( 以上二种染料可在装有双激光的流式胞仪上使用 如 Coulter,Altra 或BD Calibur 或Partec Cyflow ML 或Cytomation, Moflow) 以上列出了各荧光素的激发及发射波长的峰值 但实际上各荧光素的激发或发射波长是正态 或偏态曲线 即有很宽的范围 如下图 为FTIC PE 的发射波长 可以看到两者的发射波 长均为偏态分布 FITC 受激后多数将光源转变为525nm 左右的光 PE 多数将其转变为575nm 左右的光 故在流式细胞仪中对FITC 检测525nm 附近的光 对PE 则检测575nm 左右的光 如果此时同时使用两种荧光染料 就会出现发射光谱相互叠加的现象 根据上图中FITC 和PE 发射波长的叠加情况 在流式细胞仪检测光信号时 PE 荧光探测器 便会误检由FITC 发射的575 左右波长的光 此时计算机会将此部分信号计入PE 荧光信号 中 从而引起错误 同样PE 受激后也会发出小部分525nm 左右的光 进入FITC 荧光探测 器中 此时就需要进行一系列仪器设置 人为地去除该部分干扰 下图为其他荧光素发射波 长之间相互叠加情况 现在商业提供的荧光直标抗体上所结合的FITC PE 等荧光分子性状十分相近 其发射光的 光谱分布也十分稳定 通过一系列调节 可以推算出漏入其他荧光探测器的信号占本探测器 信号的百分比 一但设定该值 计算机会在其他探测器中减去根据的本探测器的信号乘以百 分比后的数值 如下图 其他荧光的补偿调节原理也同上图 如做FITC PE PE-Cy5 三色荧光分析原则上需要 调节的补偿有 FITC-%PE PE-%FITC PE-Cy5-%FITC PE-Cy5-%PE FITC-% PE-Cy5 PE-% PE-Cy5 六组补偿 即有23 种组合 由于在进行补偿之前的信号都已经过放大电路处理 所以 525nm 或其他波长的光信号 可被转化为任何强度的电信号 同时又因为补偿电路在放大电路的后面 故补偿过程中的百 分比数值将由两个部分决定 原荧光探测器的信号与漏进其他探测器的信号 补偿最终要达 到的效果是 漏进其他探测器的信号-原荧光探测器的信号x N%=0 由此补偿的百分比数值 将随着各灾光探测器的放大倍数 电压 变化而变化 特定电压对应于特定的补偿参数 要确定补偿中百分比数值 需运用以上调节补偿的基本原理并结合特定的标本来实现 如现进行FITC PE 双色分析 先准备该试剂的阴性对照管 A IgGFITC/IgGPE 通过调节电压 使阴性群体落在FTIC 及 PE 双阴性区 注 在 进行调补偿时 必须将原补偿全部归零 阴性对照在此处的作用是调节各荧光探测器合适的放大倍数 即归零 荧光阴性对照实 际为没有特异性的 与抗体蛋白亚型一致的动物免疫球蛋白 由于化学键 生物键及分子之 间的吸引作用 这些蛋白会与标本中的细胞结合 在流式细胞仪上可检出一定的信号 当荧 光特异性抗体与标本结合时 会产生两部分信号 非特异信