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石油降解菌Pseudomonas stutzeri RMRC PAH5奎林氧化還原酶純化與生化性質研究 指導教授 易 逸 波 博士 Yet-Pole I， Ph. D 林 忠 亮 博士 Chung-Liang Lin， Ph. D. 報告人 徐冠永 Kwuan-Yung Shi 報告架構 研究背景與現況 研究目的 文獻回顧 研究架構 研究方法 結果與討論 結論與展望 一.研究背景與現況(1) 石油主要成分包括飽和烴類、芳香族類、瀝青、樹脂等柏油類，並含有少量的氮、氧及硫化物。 自工業革命以來，稱得上是最重要的能量及物質來源，其同時可以做為燃料以及石化工業原料的性質在現代甚至是近三十年內都占有舉足輕重的地位。 一.研究背景與現況(2) 在開採、運送、產製相關原料的過程中，因人為、設備失誤或交通意外而引起工業事故，導致大量之油品或石化相關物質洩漏至環境中。這些不屬於生物體且不存在於自然環境中之外來物質分解甚為緩慢。 一.研究背景與現況(3) 大規模的原油洩漏對海生及陸生生物具有長期性危害，其中危害可以分為兩大類： 物理性危害主要是原油黏度高，遮蓋海面造成透光性及通氣性下降威脅到海底生物 化學性危害則是石油對生物具有直接毒性。 一.研究背景與現況(4) 當石油洩漏到環境中若僅依靠自然的光分解和物化作用來清除的速度相對較緩慢，目前所採取的處理方式為下面三種： 一.研究背景與現況(5) Polycyclic aromatic Hydrocarbons (PAH) 污染物中通常約 2/3 都含有雜環的結構，而含有 N 官能基的雜環化合物被稱為 NAHs (Nitrogen Heterocyclic Aromatic Hydrocarbons)。 一般係由有機物經過高溫(500~800oC)狀態下不完全氧化的熱解作用與其他有機顆粒再結合所產生的。 一.研究背景與現況(6) NAHs 在自然環境系統的降解途徑如下 1.陽光照射而產生的光氧化作用 (Photooxidation) 進而被分解 2.在水體方面的物理作用上，污染物常因水體本身的流動而被乳化，形成所謂的乳膠 (Emulsion) ，這些被水所包覆的膠體 就會因重力作用而自然沉降水底並遭底泥吸附。 3.最重要的主要降解途徑是以揮發方式，較光解或生物分解來得重要。 一.研究背景與現況(7) 本研究的對象是含氮雜環碳氫化合物中的奎林，此污染物是由兩個六碳環相連組成，其中一個碳環的第一個碳被氮元素所取代。相關衍生物是在第二、三或第四個碳的位置上被加上一個官能基 (如圖)。 二.研究目的 (1) 台灣本土所篩選出具降解奎林能力之菌株，以往研究中幾乎只針對生長最適化、酵素活性測試及代謝過程等生理作用機制進行探討。 目前對於奎林氧化還原酶(Qor) 的分子生物層面與其生化性質則未有較深入的探討。 本研究著重奎林氧化還原酶之純化與其生化性質探討研究為主要目的，針對奎林降解菌株 Pseudomonas stutzeri RMRC PAH5 的 Qor 進行研究。 二.研究目的 (2) 若能只利用酵素製劑就達到油污分解的效果，即可避免去生物復育法對環境可能產生菌相甚至於是生態系的變化。站在減少環境衝擊的角度而言無寧是一個更好的選擇。 三.文獻回顧(1) 三.文獻回顧(2)奎林降解的分解情形 某些分解菌以奎林當作基質利用其實仍需要經過一段時間的馴化動作，但直至馴化階段的菌株尚無法完全利用奎林作為唯一碳源，尤其是生長環境中有其它較易分解且可當作碳源來源的化合物，或是有抗生素存在的情況下。 但PAH5的特性並非是由一生長時期的結束來誘使另一階段的反應作用；相反的它是一種同時分解兩種以上化合物的代謝方式。 三.文獻回顧(3)酶的特性 酶，泛指所有有機催化劑 它具有幾種性質: 1.在反應中不消耗或生成 2.不改變反應物生成的總量 3.每秒鐘可催化1000到100，000個分子 在生物體內只需要很少量 三.文獻回顧(4)各種輔因子介紹 酶在作用中的活性常來自於它的構型，為了維持構型有時候會需要金屬離子，這個一般會稱為輔因子 三.文獻回顧(5)鉬酸鹽在菌體生長中的地位 奎林的環狀結構被裂解時會衍生出一鎢酸鹽的物質，進而有效的抑制分解菌的生長，故一般來說奎林降解實驗的培養基中會添加鉬酸鹽 (molybdstate) 來達到專一性對抗的目的，以利菌種的生長並維持分解酵素的活性 (Blaschke et