氨溴索在百草枯中毒大鼠肺纤维化中保护作用.doc

氨溴索在百草枯中毒大鼠肺纤维化中保护作用 　　[摘要] 目的 研究盐酸氨溴索注射液（氨溴索）对百草枯（PQ）中毒肺纤维化的影响及相关机制。 方法 将105只SD大鼠随机分为5组：正常对照组（NC组）、百草枯中毒组（PQ组）、氨溴索普通剂量治疗组（PN组）、氨溴索大剂量治疗组（PL组）、氨溴索超大剂量治疗组（PE组），采取腹腔注射法构建动物模型：NC组注射1.25 mg/kg生理盐水；PQ组注射25 mg/kg 2%PQ溶液；PN组注射25 mg/kg 2%PQ溶液+30 mg/（kgd）氨溴索；PL组注射25 mg/kg 2%PQ溶液+50 mg/（kgd）及PE组注射25 mg/kg 2%PQ溶液+90 mg/（kgd）。在模型建立后21 d处死动物，肺组织行HE和Masson染色分别观察炎症以及纤维化情况；ELISA法测定支气管肺泡灌洗液（BALF）中白介素-6（IL-6）含量，q-PCR和Western blot分别测定肺组织中组织金属蛋白酶抑制因子1（TIMP-1）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA和蛋白的表达。 结果 NC组肺组织正常，百草枯模型组大鼠肺损伤和肺组织胶原沉积明显。各剂量氨溴索治疗均能显著减少百草枯中毒诱导的大鼠肺组织胶原沉积，同时伴有IL-6、TIMP-1和TNF-α表达的显著下降（P 　　1 材料与方法 1.1 实验动物、试剂、药品及仪器 105只6周龄、体重250～310 g的SPF级SD雄性大鼠购自温州医科大学实验动物中心[合格证号：SCXK（浙）2010-0044]。本研究经温州医科大学附属黄岩医院伦理委员会批准。按常规饲养条件，在氨溴索干预后第21天，予腹腔注射2%利多卡因2 mL处死大鼠。主要试剂及药品：氨溴索（批号，德国柏林格殷格翰医药公司；脂质体、荧光素酶活性检测试剂盒，美国Promega公司；Trizol试剂、逆转录试剂，Invitrogen公司；TaqMan miRNA检测试剂盒，美国ABI公司；TIMP-1抗体（批号ESAP10803）TNF-α抗体（批号110520），美国Novus Biologicals公司；实时荧光定量9700 PCR分析仪，美国ABI公司产品 1.2 动物分组及百草枯中毒模型建立 根据随机数字表分组原则，105只大鼠随机分为5组，即：正常对照组（NC组）5只，百草枯中毒?M（PQ组）、氨溴索普通剂量治疗组（PN组）、氨溴索大剂量治疗组（PL组）以及氨溴索超大剂量治疗组（PE组）各25只。NC组按1.25 mg/kg一次性腹腔注射生理盐水；PQ组：按25 mg/kg一次性腹腔注入2%PQ液，建立大鼠PQ中毒模型；氨溴索治疗组：在PQ中毒模型成功后分别给予腹腔注射氨溴索，剂量分成30 mg/（kgd）、50 mg/（kgd）以及90 mg/（kgd）。本研究根据前期实验结果及既往研究结果[8]，30 mg/（kgd）组染毒后21 d大鼠行为、体重的变化及肺组织纤维化的病理改变，均符合百草枯中毒的特征，且在观察期内未出现死亡，故以30 mg/（kgd）的剂量作为建立模型的合适剂量。以出现饮食明显减少，静伏少动，逐渐出现目光呆滞，反应迟钝，尿量减少，甚至明显呼吸急促等典型的百草枯中毒的特征作为建模成功的标准 1.3 BALF以及肺组织的收集 处死大鼠后完整取出肺脏，气管分叉处结扎右主支气管，取出右肺组织，保存在-80℃冰箱以备用mRNA和蛋白测定；左肺给予冰生理盐水灌洗（2.5 mL×3次），回收BALF，进行低温离心（2500 r/min，离心3～5 min），取上清液，保存在-80℃度冰箱以备用；后左肺以10%中性甲醛溶液固定 1.4 ELISA法检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中IL-6的浓度 取出上述BALF标本上清，ELISA法检测BALF中IL-6的浓度，操作具体按试剂盒说明进行 1.5 HE染色半定量评价肺损伤程度及Masson染色评价肺纤维化程度 甲醛溶液固定的左肺组织，分别进行HE染色及Masson染色。采用Mikawa评分[7]方法：①肺泡充血；②出血；③间隙或血管壁中性粒细胞浸润或聚集；④肺泡间隔增厚或透明膜形成。按病变轻重，分为0～4分（0分为无或极轻微损伤；1分为轻度损伤；2分为中度损伤；3分为重度损伤；4分为极重度损伤），总分作为病理评分 Fulmer评分[8]来半定量肺纤维化：0级，无纤维化，得0分；Ⅰ级：轻度纤维化，受累面积40%，得4分；每组切片观察4个高倍镜，最后取平均值为肺纤维化得分 1.6 qRT-PCR法检测肺组织TNF-α和TIMP-1的mRNA表达 运用qRT-PCR法检测右肺组织中TNF-α和TIMP-1的mRNA表达，