以四磺基铝酞菁-牛血清白蛋白为底物的荧光恢复均相法测定胃蛋白酶.pdfVIP

第38 卷 分析化学(FENXI HUAXUE) 研究简报 第 12 期 2010 年 12 月 Chinese Joumal of Analytical Chemistry 1781 -1784 DOI: 10. 3724/SP. J.10%. 2010. 01781 以四磺基铝酥菁·牛血清白蛋白为底物的 荧光恢复均相法测定胃蛋白酶 陶云1 ， 2 黄萍2 邓雅斌2 李东辉.2 (厦门大学生命科学学院1 ，厦门大学医学院抗癌研究中心2 厦门 361∞5) 摘 要 酸性介质中，红区荧光探针四磺基铝歌菁(AlS Pc) 的荧光被白蛋白显著猝灭，加入胃蛋白酶后，体系 4 荧光明显回复。基于此现象，建立了荧光恢复均相测定胃蛋白酶的新方法。考察了各种影响因素，在最佳实 验条件(pH 2.5 、反应温度 50 c、反应时间 1 的下，本方法的线性范围为 0.04 - 4 mglL，检出限为 20μglL。 用本方法测定实际样品中胃蛋白酶，取得了满意的结果。 关键词 荧光探针;歌菁;胃蛋白酶;荧光恢复;红外区荧光 1 引言 胃蛋白酶(Pepsin) 是一种消化性蛋白酶，在酸性环境中具有较高活性[13] ，其最适宜 pH 值为1. 5- 3.0。胃蛋白酶原(Pepsinogen ,PG) 是胃蛋白酶的元活性的前体，血液中 PG 含量可作为胃基底膜功能和 病理改变的理想标志物[3] ，可应用于萎缩性胃炎和胃癌早期预防。胃蛋白酶的检测方法有:酶联免疫 吸附测定(EUSA)lυl ，它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色 反应，用于定量测定，反应产物可用分光光度计或酶标仪测定，测定灵敏度为5 -10 mglL; 考马斯亮蓝 染色法[时]，采用染料与蛋白结合在 595 nm 处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量，可检测出 1 mglL 蛋白质;火箭免疫电泳法(RIE) [8] 是将单向免疫扩散与电泳相结合的一项定量检测技术，检测 灵敏度可达0.3 m扩L。 荧光探针在生物大分子检测中得到广泛应用[9] 。例如，陈莉华等问]用 CdSe 量子点作标记物检测 人胃液中的胃蛋白酶。四磺基铝歌菁(Aluminium 怆Mt冠矶tras筒sulp阱hon 探针，具有荧光性质稳定、量子产率高等特点。酸性介质中，AlS Pc 可与牛血清白蛋白(Bovine serum albu- 4 min ， BSA) 结合，荧光显著猝灭[11 ， 12] 。在酸性条件，于AlS Pc-BSA 体系中加入胃蛋白酶，体系的荧光显著 4 恢复。基于此现象，本研究建立了胃蛋白酶荧光均相定量分析方法，并对其机理进行了探讨。 2 实验部分 2.1 仪器与试荆 l.S-55 型荧光分光光度计(美国 PerkinElmer 公司) ;电热恒温水浴锅(上海精密试验设备有限公 司) ;CHN81801 pH 酸度计(美国奥立龙公司);1 cm 石英比色皿;精密天平(Germany Sartorius 公司) ; Acy而仪)()-u 超纯水机(重庆艾科浦超纯水机公司)。 四磺基铝歌菁的合成与纯化参照文献[13] ，产物的紫外·可见吸收光谱、荧光光谱和红外光谱显示 的特征谱带与文献[14] 相符。牛血清白蛋白和胃蛋白酶均购自国药集团。其它试剂均为分析纯。所 用水为高纯水。 1. 0 mmollL AlS PC 储备液;5 g1L BSA 储备液，4 c保存备用。 5 g1L Pepsin 溶液(现 4 配)。缓冲液为0.05 moνL 的甘氨酸(Gly)-HCl 榕液(