雷公藤内酯醇体内外抗肿瘤作用论文.docVIP

　　雷公藤内酯醇体内外抗肿瘤作用论文 .freelL)处理HL60细胞24 h后,Annexin VFITC/PI荧光染色法检测凋亡率,分光光度法检测细胞caspase3酶活化程度;建立S180、U14、B16小鼠移植肿瘤模型进行体内实验,观察TPL体内抗肿瘤活性。结果TPL对MCF7、HL60、MGC803、HepG2、U266、Ca46、Hela等多种人肿瘤细胞均有很强的生长抑制作用,其IC50 分别为34.37,5.51,31.95,6.31,9.74,.freelL;TPL实验组凋亡细胞百分率显著上升,caspase3酶活化程度明显升高;对S180、U14、B16 等小鼠肿瘤均有明显抑制作用,抑制率分别达到61.0%,41.8%及58.0%。结论TPL体内体外均有较强抗肿瘤作用,其机制与激活caspase3诱导肿瘤细胞凋亡有关。 【关键词】 雷公藤内酯; 抗肿瘤药,植物; 细胞凋亡; 肿瘤 雷公藤内酯醇(triptolide,TPL)由卫矛科植物雷公藤根(去皮)提取、精制而成,是其主要活性成分之一,具有抗炎、免疫抑制和抗生育等多种药理作用,广泛用于治疗自身免疫性疾病、器官移植等。研究发现在体外实验中TPL具有很强的抗肿瘤活性14。笔者采用MTT法、荧光染色法、分光光度法及应用小鼠移植肿瘤模型对其体内外抗肿瘤作用及其机制作进一步研究。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1药品及试剂TPL由福建医科大学药学院天然药物系提供,样品经高效液相色谱分析纯度约99.9％,于实验前以丙二醇(1 mg/mL)新鲜配制,使用时以培养液稀释至所需浓度(丙二醇终浓度≤0.01％），微孔滤膜(0.22 μm)除菌。依托泊苷注射液(VP16,江苏恒瑞医药股份有限公司,批号:vp051202);丙二醇(国药集团化学试剂有限公司,批号;RPMI1640、胎牛血清(美国Gibco公司);MTT(美国Sigma);Annexin VFITC细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司,批号:060526);caspase3分光光度法检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司,批号:060830)。 1.1.2细胞株及动物MCF7、HL60、MGC803、HepG2、U266、Ca46、Hela等人肿瘤细胞由本研究所冻存提供。细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中(含青霉素100 U/mL,链霉素100 mg/L),置37 ℃、体积分数为0.05的CO2的培养箱。普通级昆明小鼠福建医科大学实验动物中心,合格证号:SCX(闽)2004002,清洁级C57小鼠上海斯莱克实验动物有限公司,合格证号scxk(沪)20030003,雌雄不拘,体质量(18±2)g。 1.1.3仪器流式细胞仪(EPICSXL,美国Backman公司);紫外分光光度计(Cary50,美国Varian公司)。 1.2方法 1.2.1MTT法检测将对数生长期的肿瘤细胞以1.5×104mL1接种于96孔培养板中,每孔200 μL,每组重复3孔。实验组加入不同浓度的TPL(2.5,5.0,10,20,50及100 ng/mL),对照组加入等体积(含0.01％丙二醇)RPMI 1640溶液(贴壁细胞预培养24 h贴壁后加药)。TPL作用48 h后加入MTT(5 mg/mL)继续培养4 h,小心吸弃上清液,加入DMSO 150 μL振荡溶解完全,酶标仪检测D(570 nm),根据下列公式计算抑制率并计算IC50: 抑制率＝1-(实验组D值/对照组D值)×100% 1.2.2流式细胞仪检测取对数生长期的HL60细胞以5×105mL1接种于6孔板,实验组分别加入25,50或100 ng/mL的TPL,对照组加入等体积(含0.01％丙二醇)RPMI 1640溶液,作用24 h后收集细胞,按Annexin VFITC/PI双染用流式细胞仪检测凋亡率,按试剂盒说明书操作。 1.2.3TPL对caspase3酶活性的影响细胞处理同1.4.2,作用24 h后收集细胞,按caspase3分光光度法检测试剂盒说明书操作,紫外分光光度计检测D值(405 nm),计算活化程度: 活化程度＝实验组D值/对照组D值 1.2.4TPL的体内抗肿瘤作用参照文献5,建立S180、U14和B16小鼠肿瘤移植模型(每只接种细胞3×106)。经预实验已摸索出TPL尾静脉给药隔天1次的最大耐受量为0.35 mg/kg。次日按体质量随机分成TPL实验组(TPL 0.0875,0.175及0.35 mg/kg),阴性对照组(1.5％丙二醇),阳性对照组(VP16 4 mg/kg)。尾静脉给药,隔天1次,连续5次,停