细菌感染大鼠血中血小板型磷脂酶A 2 mRNA 水平变化及其cDNA 克隆.docVIP

细菌感染大鼠血中血小板型磷脂酶A2 mRNA水平 的变化及其cDNA克隆 刘滔滔1 梁宁生2 杨帆2 (1. 广西医科大学第一附属医院药剂科；2.广西医科大学附属肿瘤医院药理研究室 广西南宁 530021) [摘 要] 目的 观察感染大鼠血中血小板型PLA2 mRNA水平的变化，研究其基因和氨基酸顺序结构的特征。为开发新的抗菌药物提供依据。方法 用半定量RT-PCR方法检测感染大鼠血中PLA2 mRNA，并对PLA2 cDNA进行克隆和序列分析。结果 大鼠感染细菌后，血中血小板型PLA 2mRNA水平迅速明显增加，其DNA和氨基酸结构与其它组织来源的PLA2有高度的同源性。结论 细菌感染可引起大鼠血中PLA2在基因水平上的迅速反应，这可使血小板型PLA2的生成增加并控制感染。血中克隆出来的PLA2 cDNA与大鼠其它组织来源的PLA2虽略有不同，但其酶的催化中心及基本结构完全一致。 [关键词]血小板型磷脂酶A2 细菌感染 信使RNA cDNA克隆 基金项目：广西自然科学基金资助项目：(9920012);国家人事部留学回国人员科技资助项目 作者简介：刘滔滔，女，医学硕士，主要从事抗感染药物的研究、开发和应用 血小板型磷脂酶A2(phospholipase A2 - PLA2)，也称Ⅱ型PLA2，是源于哺乳类生物的一种小分子PLA2，近年的一些实验表明，它有直接杀灭细菌的作用，并有可能发展成一种新型抗菌药物[1～3]。我们先前的一项研究显示，细菌感染的动物模型血中PLA2活性迅速增加，起杀灭革兰氏阳性细菌的重要作用[4]。本研究的目的是探讨在细菌感染中PLA2在基因水平上的反应，并从血中克隆出PLA2cDNA，研究其cDNA和氨基酸顺序的特点，增加对血小板型PLA2分子的认识，为开发新型抗菌药物提供重要信息。 1 材料与方法 1.1实验动物 体重（400±50）g，♂，Wistar大鼠，由广西医科大学实验动物中心提供。 1.2细菌 金黄色葡萄球菌标准菌株（ATCC25923），为中国生物制品检定所提供。 1.3主要试剂 总RNA提取试剂盒为Promega公司产品；RT-PCR试剂盒、质粒pMD18-T载体、感受态大肠杆菌JM109、DNA Marker均为宝生物工程（大连）有限公司（Takara）产品；UNIQ-10柱离心式质粒小量抽提试剂盒、培养基、限制性内切酶 EcoR I, HindⅢ等购自上海生工生物工程有限公司，其他试剂均为分子生物学专用试剂。 1.4引物设计与合成 大鼠血小板型PLA2引物由我们自己设计，上游引物：5’-CATGAAGGTCCTCCTGTTGCT-3’（21bp），下游引物：5’-AGCAACTGGGCGTCTTCCC-3’（19bp）,bp 。根据文献设计的大鼠β-actin 上下游引物[5]， 扩增片段为285bp。由上海生工生物工程有限公司合成。 1.5主要仪器及软件 PTC-100型PCR扩增仪( 美国MJ Research公司)、OM 3593型高速冷冻离心机（美国 IEC公司）、EC 105型电泳仪 （美国IEC公司）Version 2.0） h、1 h、3 h、6 h、24 h抽取静脉血，以注菌前的0 h静脉血做自身对照，同时另设注射等量生理盐水的阴性对照组。 1.7大鼠全血中血小板型PLA2mRNA水平测定 用半定量RT-PCR方法[7]检测全血PLA2 mRNA表达水平。PLA2和β-actin PCR扩增反应体系：10×Reaction buffer 5μl，25 mmol.L-1 MgCl2 8μl，(10 mmol.L-1 each) dNTP1μl，模板cDNA 5μl，0.4μM上游引物2μl，0.4μM 下游引物 2μl，Taq 酶（5U/μl）0.5μl，无酶水26.5μl，总体积50μl。PLA2反应程序为94℃预变性4 min，94℃变性1 min，57℃ 退火1 min，72℃延伸1 min，循环20次，最后再72℃延伸5 min。同时做6管。β-actin PCR反应程序为94℃预变性4 min，94℃变性1 min，55℃ 退火1 min，72℃延伸1 min，循环22次，最后再72℃延伸5 min。同时做6管。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检查。 1.8大鼠血小板型PLA2 cDNA片段的扩增与克隆 将上述步骤中扩增出来的PLA2PCR产物按文献方法[8]进行克隆后，送至上海生工公司测序。 2 实验结果 2.1感染大鼠血中mRNA的变化 当给大鼠静脉注入一定量的金黄色葡萄球菌，造成细菌感染的状态，大鼠血中的PLA2mRNA水平明显而又迅速的增高。从图1可看到，在正常情况下，用RT-PCR