标准名称-杭州市质监局.DOCVIP

DB3301 杭州市农业标准规范 DB3301/T 168—2010 南美白对虾传染性皮下及造血器官坏死病 快速诊断技术规程 2010 - 12 - 30发布 2011 - 01 - 30实施 杭州市质量技术监督局发布 前言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由杭州市水产技术推广总站提出,杭州市农业局归口。 本标准起草单位：杭州市水产技术推广总站、杭州萧山农发水产有限公司、杭州周宏蜂业有限公司、杭州大洋水产养殖有限公司、杭州伟林农业开发有限公司。 本标准主要起草人：叶键、陈凡、蒋静、薛国贤、周宏、张义钊、王林焕。 南美白对虾传染性皮下及造血器官坏死病快速诊断技术规程 范围 本标准规定了南美白对虾传染性皮下及造血器官坏死病快速诊断技术的术语和定义、试剂及设备、临床诊断、实验室诊断和综合判定。 本标准适用于南美白对虾成虾及其苗种、环境生物、饵料生物中皮下及造血器官坏死病毒的快速检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 SN/T 1673 对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒聚合酶链反应操作规程 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 南美白对虾传染性皮下及造血器官坏死病(IHHN) 由传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV,分类地位为细小DNA病毒科)感染15000r/min以上，适用于1.5mL离心管。 器具 剪刀、镊子等，高压灭菌后备用。 临床诊断 活动情况 病虾常漫游于水的表面，行动迟缓、厌食、虾体翻转、腹部朝上。 外部检查 病虾生长缓慢，体表甲壳出现白色或褐色斑块，额剑变形弯曲，体表及鳃上粘附污物，肌肉不透明，许多个体在蜕壳时或蜕壳后死亡。 实验室诊断 样品采集和保存 按SC/T 7103规定采集，将待检样品置于容器内，浸没于95%乙醇中，于常温密封保存，至多保存1个月。 取样 经6.1采得的样品按SN/T 1673第5章第1条规定取样。 核酸提取 裂解 经6.2处理后的样品，置于灭菌研磨器中充分研磨成糊状，用灭菌牙签挑取约10mg（约1?/3米粒大小），置于0.5mL灭菌离心管内，滴入10滴病毒裂解液，用灭菌牙签捣碎至悬浊液。 吸附 将上述离心管置于离心机内，12000r/min离心3min，将上清液转移至新的0.5mL灭菌离心管内，加入20μL核酸吸附液（用前充分混匀）混匀；室温放置5min，期间摇匀3次。 洗涤 将上述离心管置于离心机内，10000r/min离心30s，弃上清，再离心5s，吸干残余液体，滴入10滴洗涤液于沉淀中，振动离心管使沉淀充分悬浮；将离心管置于离心机内，10000r/min离心30s，弃上清，再离心5s，吸干残余液体。 PCR反应 将含沉淀的离心管开盖置于PCR扩增仪上，60?C加热3min；加20μL蒸馏水，充分悬浮沉淀，将离心管置于离心机内，10000r/min离心30s，取上清2μL于红色反应管（内含PCR反应液及引物）中，加IHHNV-PCR稳定液13μL，将离心管置于离心机内，10000r/min离心3s，即可做PCR反应。阳性对照及阴性对照直接取2μL于红色反应管中，加IHHNV-PCR稳定液13μL，即可做PCR反应。反应过程为：95?C2min；94?C 30s/68?C1min，共40个循环； 68?C延伸2min。反应完成后4?C保存。 电泳 将制备好的琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，使电泳缓冲液刚好没过胶面；取PCR反应管下层红色液体10μL加入样品孔，5V/cm电泳约30min。 结果观察和判定 凝胶成像仪或紫外灯观察扩增带，阳性对照有一条246bp的清晰亮带；阴性对照在平行位置无条带，若阳性对照未出现246bp条带或阴性对照出现条带时，均需重新进行PCR实验。样品如在246bp位置出现条带，为皮下及造血器官坏死病毒阳性，否则，为皮下及造血器官坏死病毒阴性。 综合判定 待检样品临床诊断结果符合5.1和5.2的规定，实验室检测符合6.6阳性规定，判定样品为传染性皮下及造血器官坏死病感染；临床诊断无症状，但实验室检测符合6.6阳性规定，判断样品携带传染性皮下及造血器官坏死病毒。 （资料性附录）相关试剂 对虾传染性皮下及造血器官坏死病毒PCR检测试剂盒 对虾传染性皮下及造血组织坏死病病毒(IHHNV)PCR检测试剂盒，包含有以下组分：PCR混合反应管、IHHNV-PCR稳定液、IHHNV阳性对照和阴性对照、样品裂解液、吸附液、洗涤液、电泳缓冲液（50×）、灭菌牙签、琼脂糖粉（含EB）、蒸馏水等。其中PCR混合反应管、IHHNV