生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法测定氯胺酮.pdfVIP

HUAXUE)研究简报 第1期 第38卷 分析化学(FENXI of ChineseJournal 117。120 2010年1月 AnMyticMChemistry 生物素一亲和素放大酶联免疫吸附法测定氯胺酮 张雯迪 苏萍 杨屹。 郭振泉 (北京化工大学理学院，北京100029)(北京大学生命科学学院，北京100871) 摘要建立了检测氯胺酮的生物素．亲和素放大酶联免疫吸附测定法(BA．ELISA)。实验最佳测定条件：抗 原包被浓度为2．0rng／L、氯胺酮单克隆抗体浓度为10．2 mg／L，生物素化羊抗小鼠IgG(Biotin-lgG)和酶标链 霉亲和素(SA-HRP)的最佳反应浓度分别为0．29和1．0 mg／L。在此优化条件下，方法的线性范围为0．1— 1000灿g／L；检出限为0．03tLg／L。氯胺酮生物样品的加标回收率为94％一102％。与酶标二抗体系ELISA法 相比，BA—ELISA具有更高的灵敏度，适于低浓度氯胺酮的检测。 关键词氯胺酮；单克隆抗体；生物素一亲和素放大酶联免疫吸附法 1 引 言 于小手术、小儿检查或诊断操作时麻醉诱导及辅助麻醉uJ。氯胺酮具有一定的兴奋、致幻和依赖性，近 年来，其滥用现象日益严重。检测氯胺酮方法主要是色谱法瞳“j。由于生物样品的基体复杂，前处理 步骤繁琐，色谱方法不适合大量样品的现场检测。因此，建立一种快速、可靠和低成本的氯胺酮检测方 法具有重要意义。 免疫分析具有特异性强、选择性好等优点，可对复杂体系中痕量物质进行快速灵敏检测，被广泛应 本实验利用制备的氯胺酮单克隆抗体，采用生物素一亲和素放大酶联免疫吸附测定法，检测人体血清和 尿液样品中的氯胺酮，具有高特异性和高灵敏度等特点。 2实验部分 2．1仪器与试剂 国Costar公司)；牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)和3，37，5，5’一四甲基联苯胺(TMB，美国Sigma 博奥森生物技术有限公司)；溴代乙酰溴(山东金城医药化工股份有限公司)；氯胺酮、去甲氯胺酮和可 卡因(中国药品生物制品检定所)；吗啡(青海制药厂)；其它试剂均为国产分析纯，实验用水为重蒸的去 离子水。 2．2实验步骤 2．2．1氯胺酮全抗原的合成取100mg氯胺酮和300mgK：CO，溶于20mL甲苯中，在氮气保护下向上 h。将所得溶液旋转蒸干，用磷酸盐缓冲溶液溶解 述溶液中缓慢加入500灿溴代乙酰溴¨J，常温搅拌5 残渣。将含有BSA的磷酸盐溶液缓慢加至上述溶液，搅拌过夜，冷冻干燥即得氯胺酮全抗原(Ketamine． BSA)。全抗原(Ketamine—OVA)的合成方法与Ketamine—BSA相同。 2．2．2氯胺酮单克隆抗体的制备及纯化【s1用制备好的全抗原多次免疫小鼠后，取其脾细胞与骨髓 瘤细胞Sp2／0融合，获得氯胺酮杂交瘤细胞，经筛选和克隆化后，将稳定分泌氯胺酮单抗的杂交瘤细胞 株进行冻存。实验时将其从液氮罐中取出传代培养，状态良好后注射人小鼠腹腔内，两周后收集腹水。 2009-06-09收稿；2009．10-07接受 本文系国家自然科学基金(No资助项目 ·E—mail：y∞syi@mail．buct．edu．CR 118 分析化学 第38卷 计算纯化后氯胺酮单克隆抗体的蛋白浓度[9]，于一20℃保存。 2．2．3生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法的测定步骤参考文献[10]，用抗原溶液包被96孔板， 4℃下放置过夜。次13用明胶溶液封闭2 h。再依次加