骨髓间充质干细胞诱导分化视网膜神经样细胞研究进展.docVIP

骨髓间充质干细胞诱导分化视网膜神经样细胞研究进展视网膜色素变性及老年性黄斑变性是严重威胁视力的疾病，目前临床上缺乏有效的治疗方法。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs) 有跨胚层分化能力，在一定的条件下可以向神经细胞分化。大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化成为视网膜色素细胞的研究为此类疾病的治疗带来了希望，成为近年来该领域的研究热点。本文对近年来不同培养条件对大鼠骨髓间充质干细胞定向诱导分化的影响以及视网膜前体细胞眼内移植的进展综述如下 1 BMSCs体外诱导实验 BMSCs向某一特定细胞的分化，必须依靠相应微环境所提供的各种营养因子来完成。原始视网膜发育的微环境是最适宜的微环境，这种微环境提供了BMSCs定向诱导分化所具备的各种生长因子以及营养成分。人工诱导分化干细胞的方法，就是对这种微环境的模拟。模拟的准确性越高，分化效率也就越高 1.1单用诱导介质 1.1.1碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)：碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)诱导方法是诱导BMSCs向神经元方向分化的经典方法，其优点是可以获得较多的神经元样细胞，分化的阳性率为78%。刘东宁等[1]用bFGF诱导后结果与Woodbury一致。用bFGF诱导后细胞GFAP表达阴性，认为主要是向成熟神经元方向分化，而不是神经胶质细胞。诱导后从形态学上在细胞间建立了突触联系，但诱导后细胞难以长期存活，需联合其他神经营养因子进行维持培养，才利于长期存活。在培养中，刘东宁等用含10 ng/mL bFGF进行接触性的诱导，有报道是用XX年来，BMSCs的三维培养已用于骨、软骨、肌腱和脂肪等组织的工程研究，其主要的支架材料为明胶海绵、水凝胶、β-磷酸三钙及聚己内酯等。但应用在神经元细胞上未见相关报道 羊膜(human amniotic membrane，HAM)基质：王晶等[4]采用人的HAM基质负载BMSCs定向诱导分化为神经元样细胞。在实验中，观察到BMSCs接种到HAM基质上后能很快贴附生长，细胞活力好，折光性强，第3-10天可在HAM基 质面密集生长，这与张妍等报道相同。王晶等则认为，把HAM基质作为细胞培养载体具有以下的优点：HAM基质主要成分为胶原纤维和网状纤维，其三维支架结构为神经元样细胞及其轴突的生长提供了广阔的空间；HAM基质免疫原性低，具有良好的生物相容性和抗炎性；HAM基质内的EGF、bFGF等多种生长因子为细胞的增生和分化提供了丰富的营养成分，HAM内可能产生的某种未知的有很强神经保护作用的因子，为神经元样细胞及其轴突的生长提供了更多的营养支持 2.2三维支架的诱导剂 王晶等[4]以HAM基质作为载体，以新出生1～3 d的乳鼠视网膜细胞作为诱导剂进行非接触培养。以HAM基质为载体，以2-巯基乙醇（DMEM/F12）接触培养将其诱导定向分化成神经样细胞。关于二种实验方法的效果比较未见相关报道。也未见借用HAM基质作为载体和单用乳鼠视网膜细胞作为诱导剂这二种诱导方式效果比较的相关报道 3 BMSCs体内移植实验 BMSCs移植入体后，如何从受体辨别供体干细胞，并观察其在体内的迁移变化情况，一直是让人困扰的问题。近年来，主要运用的标记物有以下几种 3.1 超顺磁性铁纳米颗粒(SPIO)。SPIO是研究发现的新型磁共振阴性对比剂，可在活体标记神经干细胞。Frank等研究发现SPIO颗粒与转染试剂结合后标记干细胞比使用单纯SPIO颗粒高100倍。陈舒泽等[5]研究发现，SPIO的浓度对此有至关重要的影响：浓度过低无法达到较高的标记效率满足MR的需要。在标记浓度为11.2mg/L左右时，既能达到较高的标记效率，又不影响视网膜前体细胞的体外生长增殖，但这与有些文献报道不同。转染剂结合SPIO并无短期或长期毒性作用 3.2 溴脱氧尿嘧啶(BrdU)。BrdU是胸腺嘧啶类似物，移植的细胞与含有BrdU的培养基一起孵育，让它取代胸腺嘧啶而掺入处于DNA合成期细胞的DNA中作为标记，用免疫荧光或免疫组织化学显示移植的细胞。BrdU作为标记应选择适当的浓度，采用质量浓度为10μg/mL的BrdU标记的了BMSCs与未做标记的细胞生长情况基本相同，在荧光显微镜下可见BrdU标记的MSCs细胞核被染色，未做标记的细胞不着色 3.3 细胞荧光黄(LY)。显微镜下选取诱导后1 d形态和活性良好的细胞，将细胞爬片置于灌流槽中。电极拉制器拉制玻璃毛细管微电极，注入电极液后电阻范围为8～12mΩ。调节微操纵器，使电极尖端接近细胞，利用特定的测试方波电脉冲形成封接，在电极尖端接触细胞表面之前，向微电极加正压。当接近细胞时，给予短暂负压