李劲松实验报告real-timePCR.pptx

Real-time PCR使用及引物筛选时数据分析;报告内容;1 Real-time PCR原理;2 PCR体系配制;3 Real-time PCR软件操作; Melt Curve： 95 ℃X 15Sec ， 55 ℃X 15Sec , 95 ℃X 15Sec 。 循环程序设计图;3.1.4 排版设计 3.1.4.1 Assays设计 Assays设计可以把排版中的48个孔进行归类设计，设计为一类的孔对应的曲线图一定会在同一窗口中显示，不同类的孔可以选择同一窗口显示或不同窗口显示。我们在实验中把同一对引物的孔归为一类。 3.1.4.2 Samples设计 在排版中设为同一samples空所对应的曲线图将被标致同一种颜色。我们在实验中把同一对引物（可理解成3.1.4.1中的一个类）根据模板的不同分成不同的samples。 ; ;3.2注意事项 ;4 Real-time PCR的两个用途 ; Log2m= Log2n2c /两边同取以2为底的对数 Log2 m= Log2n + Log22c Log2 m= Log2n + c m表示DNA分字数，经过一定的转换（由荧光染料及激发状态决定）就成了荧光值，在延伸实验中可任意设定，设定后称为荧光闸值。因此n的以2为底的对数与能使得荧光值达到m的循环数C成线性相关关系，因此可用一组已知浓度梯度的DNA模版进行PCR实验，可以得到一条关于Log2n与C的线性回归曲线，然后在同样的m值与相同的混合体系下，对未知浓度的DNA进行PCR后得到C值，把C值带入线性曲线即可求的未知DNA浓度。 ; 荧光值—循环数图（DNA延伸曲线）; Cq值—初始DNA分子量对数回归曲线; 事实上，在每个以（温度X时间）变化作为循环的过程中，体系内的每个DNA分子并不一定 都能同步完成DNA复制过程，因此我们把e作为DNA分子在每个（温度X时间）循环中的扩增效率。在DNA双链形成前荧光物质也会有个初始荧光值m0故实际的荧光值： m = nK（1+e）c + m0 注：k表示双链DNA分字数与荧光增加值关系系数 ;4.2 DNA定性与溶解曲线 DNA双链主要通过H键保持相对稳定的双链结构，AT间2个H键，GC间通过3个H键相连。因此不同长度、不同GC比例的DNA双链的键能通常会不相同。在相同的温度下，具有不同键能的DNA分子热稳性不同，具体表现为升高同样的温度后，DNA分子的溶解情况会不同。 我们做的SNP分子标记筛选正是利用该原理。由于一段核苷酸链上某个碱基的突变，比如C突变为T，这时发生碱基突变的双链DNA分子H键总数会比原链少一个，其分子热稳性也发生改变。通过对DNA分子间热稳性微小差异的分析即可区分仅有一对碱基不同的DNA分子。当然如果GC或AT互相发生突变时，双链DNA分子的键能将不会改变,因此该方法 就有局限性了（？）。 ;荧光值—温度图（DNA溶解曲线）; 相对荧光百分率—温度图（DNA溶解曲线）;5 当前所遇问题及可供参考的解决方向; DNA溶解曲线; 作为反例的引物11-1情况似乎没有那么好,所以我们在引物筛选时很快 认定该引物的扩增片段不存在SNP。如下图所示：; 事实上我在一次调试“自动寻找最佳分离温度代码”的过程碰巧用到了引物11-1的数据，运行结果显示该引物在87℃附近出现最佳分离温度，这令 我对自己编写的代码特别失望，因为平时寻找出的最佳分离温度很小有超过80 ℃的。不甘心的我打开Eco文件找了将近30分钟，将用于调整图像的四根竖线分别放在85.2， 86.0，87.2，87.8处时引物11-1所扩出的目的片段的溶解曲线表现出了了SNP，如下图所示：;DNA溶解曲线; 由于各种噪音的影响，原始的荧光数据很少能用作直接进行SNP区分的，而是要对荧光数据进行各种降噪处理后才能用于SNP的判定。 Eco软