海藻糖-6-磷酸合成酶转基因烟草提高耐盐性的研究.pdfVIP

植物学通报Chinese Bulletin ofBotany 2008，25(1)：41—49，WWW．chinbullbotany．com - 研究论文- 海藻糖．6．磷酸合成酶转基因烟草提高耐盐性的研究 郭蓓’一，胡磊’，何欣2，陈雪梅 ，蒋湘宁’ ’北京林业大学生物科学与技术学院，国家林业局树木花卉育种生物工程重点开放实验室，北京 1 00083 北京农学院生物技术系，北京 1 02206 摘要 海藻糖一6一磷酸合成酶(trehalose一6一phosphate synthase，TPS)是海藻糖合成途径中的一个关键酶，近些年来受到广 泛关注．以往的研究多数集中于细菌和真菌等，而对植物体内TPS基因的研究较少。为此，我们首先通过RT—PCR(reverse tran— scription PCR)克隆得到了拟南芥的TPS基因，进而将其构建到原核高效表达载体pET30a(+)~．并在大肠杆菌BL21中进行高 效诱导表达。在确认该基因能够在体外正常表达之后．将其构建到植物表达载体上并转人烟草体内，通过实时荧光定量PCR 检测，证明在转基因个体中目的基因已经在受体基因组上完成整合，并且在其中的2个个体中实现了正常转录。在对目标个体 进行海藻糖含量的测定以及抗逆性实验后发现，s5个体具有良好的表现，其体内海藻糖的含量明显高于其它个体，并具有较强 的耐受盐胁迫的能力。 关键词 基因克隆与异源表达，实时荧光定量PCR，胁迫耐受，转基因植物，海藻糖．6-磷酸合成酶 郭蓓，胡磊，何欣，陈雪梅，蒋湘宁(2008)．海藻糖-6-磷酸合成酶转基因烟草提高耐盐性的研究．植物学通报25，41—49． 海藻糖是一种安全、可靠的天然糖类，其分子内不 藻糖。赵恢武等(2000)将酵母的tps基因、戴秀玉等 存在醛基，为非还原性糖。它是糖类物质中性质最为稳定 (2001)将大肠杆菌的ost基因转入烟草，使其耐旱性增 的双糖(Paiva and Panek，1 996)。正是因为海藻糖对 强。王自章等(2003)将担子菌灰树花的Tsase基因转 生物体具有神奇的保护作用，所以近年来有关其生理生 入甘蔗，增加植株的抗渗透能力。 化及分子生物学方面的研究受到广泛关注。 在克隆利用低等生物TPS基因的同时，人们也试图 目前人们研究海藻糖的主要策略之一，是通过对海 发现与利用植物体内本身固有的TPS基因。Blazquez 藻糖合成途径相关基因的克隆与表达研究，增强其合成 等(1 998)和Vogel等(2001)分别克隆得到拟南芥的TPS 途径的代谢。从而实现海藻糖在生物体内的富集。其中海 基因，并使其在酵母突变体中实现功能表达。Avonce 藻糖-6-磷酸合成酶~rehalose-6-phosphate synthase， 等(2005)研究了 )S基因在拟南芥不同生长部位的高效 TPS)成为主要关注对象之一，许多科学家在此方面进行 表达情况。Eastmond等(2002)发现。在拟南芥中TPS 了不懈的努力。Pilon-Smits等(1 998)及Goddijn和van 对胚芽的成熟同样具有不可缺少的作用。 Dun(1 999)克隆了大肠杆菌中的TPS编码基因，并实现 在前人对大肠杆菌和真菌等体内TPS基因的研 了对烟草的转化。Garg等(2002)将大肠杆菌中的海藻 究与利用的基础上。我们试图开展对植物体内TPS 糖合成酶基因otsA和otsB进行融合，并成功地获得了 基因的开发研究。为此。在本实验中我们首先克隆 转基因水稻。Kjell-Ove等(1 996)利用酵母 s7车专化烟 得到拟南芥的TPS基因，在确认该基因能够在体外 草，以1，5．二磷酸核酮糖羧化酶加氧酶(ribulose-1，5- 正常表达之后，将其转人烟草体内，通过real·time bisphosphate carb0xyIase，0xygenase。Rubisco)的小 PCR检测方法，鉴定出该基因在受体中的整合与转录 亚基启动子控制其转录，使转基因烟草中积累少量的海 表达情况。 收稿日期：2007．06-01：