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第35卷 分析化学(FENXI HUAXUE) 研究报告 第12期 2007年12月 Chinese Journal of Analytical ChemistH 1731—1735 伏安免疫法检测牛奶中氯霉素残留 宋巍巍 丁明星 张挪威 刘海峰 徐明刚 刘国艳 柴春彦 (华中农业大学动物医学院，武汉430070) (上海交通大学农业与生物学院，上海201101) 摘 要 为探索用于现场检测牛乳中氯霉素(CAP)残留的高灵敏度及特异性强的免疫传感器方法，本实验在 制备CAP单克隆抗体的基础上，以卵清蛋白-氯霉素(OVA-CAP)偶联物为包被抗原，并将其包被到聚苯乙烯 反应板上；在孵育反应中，样品中的CAP与OVA-CAP竞争结合CAP单克隆抗体，洗涤后加入碱性磷酸酶 (ALP)标记的二抗，经再次孵育及洗涤后加入对硝基苯磷酸(pNPP)底物液；反应终止后用线性导数伏安法记 录pNPP水解产物的氧化峰电流。实验结果表明，用免疫传感法测试CAP的灵敏度高于传统的问接竞争酶联 免疫吸附法(ELISA)。该方法检测CAP的检出限为0．064 p．g／L；检测线性范围为0．15～600 晷／L，测试牛奶 样品的平均回收率为89．8％。另外，由于免疫电化学传感器体积较小，便于携带，操作简单，可实现牛乳样品 中CAP残留的现场检测。 关键词 氯霉素，微分脉冲伏安法，免疫传感方法 1 引 言 氯霉素(Chloramphenicol，CAP)曾作为广谱抗生素广泛应用于养殖业。但由于其具有严重的毒副 作用，残留于动物性食品中的CAP严重威胁着人类健康。因此，许多欧美发达国家早已限制或严格禁 止CAP应用于食品动物，并对动物性产品中CAP的最高残留限量制定了严格的标准。我国农业部于 2002年12月规定CAP及其盐、脂等在食品动物的所有可食组织中不得检出。但由于CAP低廉的价格 和稳定的抗菌性，在畜牧业及水产养殖业中违法使用的现象仍屡见不鲜。到目前为止，国内外用于生物 样品中CAP残留检测的方法和技术主要有免疫分析法、色谱法和色谱．质谱联用技术¨山 等。但这些 方法往往存在操作繁琐、分析速度慢等不足。采用伏安免疫传感法测定CAP尚未见文献报道。 研究发现，对硝基苯磷酸(pNPP)被碱性磷酸酶(ALP)催化水解的产物对硝基苯酚可于1．20 V( ． Ag／AgC1)左右在玻碳电极(GCE)上被氧化，而在此电位下，其本身无电活性 J。所以，可用电化学方法 对其进行检测。本研究建立了以问接竞争ELISA为基础，ALP为标记酶，pNPP为底物，伏安法为检测 法的伏安免疫分析体系，与传统的ELISA方法相比，此法灵敏度高、特异性强。 2 实验部分 2．1 仪器与试剂 CHI1230多功能伏安仪(上海辰华仪器有限公司)；测试采用三电极系统：玻碳电极为工作电极(天 津兰标电子科技发展有限公司)，对电极和参比电极分别用铂柱和Ag／AgC1电极(上海精密科学仪器有 限公司雷磁仪器厂)。数据采集利用ZF．10B数据采集贮存器(上海正方电子电器有限公司)。牛血清 白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)福氏完全及不完全佐剂、 N即、AIJP标记羊抗鼠二抗(IgG)及CAP琥珀 酸钠标准品(Sigma公司)；RPMI．1640培养基、次黄嘌呤 胸腺嘧啶核苷酸(HT)及氨基喋呤(HAT)溶液 (Gibco公司)；小牛血清(上海阿敏生物技术有限公司)、小鼠骨髓瘤细胞(SP2／0)(中国科学院上海动 物研究所惠赠)。其它试剂如冰乙酸、硼酸、柠檬酸、甘氨酸、正己烷、乙酸乙酯、磷酸等均为国产分析 纯。瞬时灭菌包装的鲜奶(上海市某超市)。 2007-04-06收稿；2007-08-01接受 本文系国家自然科学基金资助项目(No和上海市科委攻关计划项目(No．06dz05040)资助 $E—mail：cychai88@sjtu、edu、cn 分析化学 第35卷 2．2 实验方法 2．2．1 氯霉素抗原的合成及单克隆抗体的制备 CAP免疫全抗原(BSA—CAP)、载体全抗原(OVA— CAP)的合成参见文献[8]所介绍