荧光PCR在进京活禽和禽产品中禽流感病毒快速检测中的应用.pdfVIP

家禽科学2008．1 荧光PC R在进京活禽和禽产品中 禽流感病毒快速检测中的应用 韩春来(北京市动物卫生监督所 100044) 中图分类号：$851．34+7 文献标识码：B 文章编号：1673—1085(2008)1-0032—02 2008年奥运会秉承“科技奥运、绿色奥运”的 1．2．1．1 步骤 根据本质量体系文件中的《开展新 理念。对动物和动物产品的无疫安全性提出了严格 工作项目的管理程序》，开展新项目前审核的内容 的要求，发展一种快速、灵敏的检测方法对进京禽 包括：检测依据标准、原始记录格式、检验报告格 类和禽产品进行评价．保证北京市上市禽产品的安 式、开展新项目所需的技术资料是否齐全．相应仪 全是一项重要的工作。传统的鸡胚病毒分离虽然灵 器设备的购买、检定情况和档案情况．试剂盒是否 敏，但耗时较长、过程繁琐，而酶免疫测定技术、核 具有兽药批准文号、供应商是否有合法的资质。采 酸探针技术、NASBA等快速检测方法目前尚未标 购物品情况，试验是否有记录，能力比对、检测结果 准化。禽流感病毒荧光RT—PCR检测方法．在检测 是否符合标准要求。证实以上内容和试验结果符合 活禽和禽组织中禽流感病毒的灵敏度与鸡胚病毒 标准要求并经过3次以上检测成功后。方可确认。 分离一致，具有快速、敏感、特异的特点(整个检测 1．2．1．2 能力比对和验证 内部能力比对：对同样 过程仅需4h)。是目前市场上得到国家一级兽药证 的样品，采用同批次试剂盒。不同的检验人员在相 书的检测试剂。近年来．北京市农业局、市动物卫生 同的环境中完成RNA提取、加样、荧光PCR运行 监督所为保障外埠屠宰进京家禽无疫安全采取了 等操作，比较试验的结果。外部验证：对同样的样 以“屠宰企业自检为主、官方抽检为辅”的食品安全 品，采用同批次试剂盒，与经过计量认证的检测机 抽检方式，将荧光PCR应用于外埠进京活禽和禽 构进行外部能力比对，验证检测能力。 产品中禽流感病毒监督检验的抽检中．为完善进京 1．2．1．3 检验步骤的控制 在国家标准 GB／ 禽类无疫安全保障技术平台奠定了基础。在本研究 T19438．1—2004的步骤基础上，将样品的整理、取样 中，采集外埠进京活禽的鼻腔棉拭子和屠宰后的组 工作从整个试验步骤中分离出来，进行样品的集中 织样品，采用荧光RT—PCR方法进行禽流感病毒的 处理，提高效率；加强检验环境的通风和废液的安 检测和分型．将此方法通过确认和能力比对．以验 全处理。对照标准要求评审检测工作．证实其结果 证其可行性。 符合标准要求。经过3次以上检测并有3次成功 1材料和方法 后．得到最后的确认。 1．1 材料 1．2．2 在实际检测中的应用 1．1．1 试剂 禽流感病毒通用荧光RT—PCR试 1．2．2．1 样品采集 每季度采集外埠进京的鸡鸭 剂盒及禽流感病毒H 、H 、H 亚型荧光RT—PCR试 泄殖腔棉拭子、禽肉和肾脏共180份．样品产地以 剂盒，购自深圳匹基生物工程有限公司。 河北和天津为主。组织样品采集后放入无菌密封袋 1．1．2 仪器 BioBard Chrom4型荧光 PCR仪． 中，棉拭子采集后放入盛有1．0ml 0．01M PBS(含青 Sigama 3K1 8高速冷冻离心机 。 霉素和链霉素各10000IU／m1)的5ml离心管中．于 1．2 方