人乳头瘤病毒基因检测及分型方法研究进展.docVIP

　　人乳头瘤病毒基因检测及分型方法研究进展 【摘要】 流行病学和分子生物学资料表明，人乳头瘤病毒(HPV)的感染能够引起子宫内上皮样瘤变(CIN)及宫颈癌的发生。并且HPV的不同型别致病力也存在差异,高危型别、高病毒载量的持续感染是促使宫颈癌发生的重要因素。因此，HPV感染的早期发现、准确分型及病毒定量对宫颈癌的防治具有重要意义。对HPV基因的检测和分型方法如核酸杂交、PCR、荧光定量PCR等，以及各方法的优缺点进行综述。 【关键词】 人乳头瘤病毒; 聚合酶连反应; 实时荧光定量; 分子信标; 文献综述 　人乳头瘤病毒(human papillomavius，HPV)是促使子宫内上皮样瘤变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)及宫颈癌发生的已知的重要因素[1-2]。德国学者Harald zur Hausen因发现了HPV与宫颈癌之间的关系获得了2008年诺贝尔生理或医学奖。HPV具有多种型别，分为高危型和低危型，不同的型别致癌潜能存在差别。高危型、高病毒载量的持续感染可以引起宫颈癌的发生[3]。2009年5月召开的第25届国际乳头瘤病毒会议，说明了全球HPV的感染率呈上升趋势，并且出现了新的基因型别[4]。在我国，宫颈癌的发病率也呈上升趋势并且趋于年轻化，因此，HPV感染的检测、病毒定量、基因分型对临床宫颈癌的防治具有重要意义。在相关资料的基础上，我们对HPV基因的检测和分型方法如核酸杂交、PCR、荧光定量PCR等，以及各方法的优缺点进行了系统的综述，以期进一步建立可靠、简便、快速的HPV检测、定量、分型方法。 　　1 HPV的结构 　　HPV为双链环状DNA病毒，基因组约8 000 bp，分为早期编码区(early region)、晚期编码区(late region)、非编码区(noncoding region)，含8个可译框(open reading frame，ORF)，其中早期ORF 6个、晚期 ORF 2个。它属于无包膜病毒，由DNA核心和衣壳组成，结构示意图如图1。 　　图1 HPV基因组结构示意图 　　Fig 1 Schematic of HPV genome 　　2 HPV的分型 　　HPV根据生物学特征、致癌潜能可分为高危型(high risk)和低危型(loer mediated PCR)利用通用引物实现广谱HPV的扩增，采用多种方法对扩增产物进行分析，实现HPV的基因分型。 　　引物设计针对HPV各型别间的保守区域。在HPV基因组中L1区最为保守，因此目前常用的通用引物大都针对L1区。如GP5+/6+，可扩增150 bp，该体系需较低的退火温度;MY09/11及其改良的PGMY，可扩增450 bp，该体系无需较低的退火温度;SPF10，可扩增65 bp，不含简并碱基但是含有黄嘌呤，黄嘌呤可以和任意碱基配对，因此引物重复性好，可在优化的退火温度下进行，提高了PCR扩增效率[8]。可根据实际情况选择不同的引物。 　　通用引物PCR的扩增产物可用直接测序法、限制片段长度多态性分析、反向杂交、基因芯片实现基因分型。 　　3.2.2.1 直接测序法 直接测序可以检测包括少见型别和新型别在内的HPV所有基因型别，尤其对同源性差的HPV基因型能提供强的序列信息，并可提供已知HPV型别的突变信息,是一种较为可靠的方法。但该方法费时、昂贵，并且HPV混合感染时检测灵敏度不高，限制了其在体外诊断中的应用。 　　3.2.2.2 限制片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism,RFLP) 采用的限制酶大多为BamHⅠ、DdeⅡ、HaeⅢ、HinfⅠ、PstⅠ等。不同的HPV型别具有不同的序列、限制性酶切位点，当 用限制酶酶解DNA时，产生不同的限制性片段，因此不同的型别呈现不同的电泳条带模式，据此可判断HPV型别。该方法相对简单，无需特殊仪器设备并且费用较低。因非特异产物影响酶切后分型的判断，因此RFLP要求PCR产物具有较高的纯度。 　　3.2.2.3 反向杂交 反向杂交是PCR扩增产物与多个固相化的寡核苷酸探针进行杂交。探针最常为平行线性排列，因此常称之为线性平行杂交(line probe assay，LiPA;line blot assay，LBA;liner arry，LA)[8]。基本原理为：将多个探针平行固相化于一个膜内，用生物素标记的引物扩增目的基因片段，双链PCR扩增产物在碱性条件下变性后加入固定有探针的膜，然后进行杂交、洗涤，最后依次加入链霉素生物素复合物和底物进行显色，根据探针条带上紫红色沉淀判断对应基因型别。该方法用样量少、灵敏度高，可同时分析HPV混合感染中的不同型别。 　　除反向杂交外，HPV P