铜化合物水解肌红蛋白活性位点的质谱研究.docVIP

　　铜化合物水解肌红蛋白活性位点的质谱研究 【摘要】 以铜化合物为金属模拟酶，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳研究它们对肌红蛋白的水解作用，利用高效液相色谱电喷雾质谱的测量方法替代传统的N端氨基酸序列分析结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱或电喷雾质谱方法来检测得到的多肽片断分子量，据此确定水解反应的活性位点。结果得到分子量为10093.0，10388.0，6876.0和6581.0的4个片段，分别对应于Gly191，Gly1Ala94，Ser92Gly153和Thr95Gly153， 表明Cu2+通过与肌红蛋白中His93的侧链配位，水解断裂位于其前后沿的第2个肽键，即：Gln91Ser92和Ala94Thr95，水解反应具有很高的选择性。位于His93前沿的活性位点特征与过去的研究结果一致，而His93后沿的活性位点，即His93Ala94Thr95序列中Thr95 N端是一个新位点。 【关键词】 铜，肌红蛋白，高效液相色谱电喷雾质谱联用，水解作用 　　1 引 言 　　多肽和蛋白的水解是化学和生物化学过程中最为重要的反应之一，也是研究分析生物化学以及蛋白质结构与功能的最重要任务之一。蛋白的序列分析、蛋白结构与功能研究、蛋白质与核酸的相互作用以及新型化学治疗药物的合成等方面均涉及此类反应。目前, 可用于促进多肽和蛋白水解多采用蛋白水解酶，它们能水解诸如磷酯、蛋白质和DNA这类大分子。但这些酶为数甚少，远远不能满足蛋白质结构与功能以及工程学研究的需要， 而且这类生物化学试剂制备困难、价格昂贵。因此， 人们一直在探求能够替代或补充这类水解酶的化学试剂。由于某些肽酶是以金属离子为活性中心的，因此， 长期以来人们把一些金属化合物作为金属肽酶模拟物加以研究。早期工作大多集中在研究酰胺化合物中酰胺键断裂的结构要求及其机理，自20世纪90年代起才在小肽和蛋白质肽键的水解方面取得突破性进展。所采用的金属元素也日趋多样，其中包括Co[1]，Ni [2]，Cu[3～5]，Pt[6]和Pd[7,8]等，研究的对象也从小肽发展到直接使用天然蛋白或基因工程产生的蛋白质[9～11]。 　　Cu2+是一种具有人工金属酶活性的过渡金属离子，可以选择性地水解断裂多肽和蛋白。但要使Cu2+成为分析生物化学和蛋白工程中被广泛接受和采用的试剂，还需要对不同蛋白进行一系列的实验，来确定其水解效率、选择性和其它相关性质。在生物体系中具有储存和运输氧功能的肌红蛋白(Mb)，其大小中等，结构信息已知，非常适用于研究过渡金属化合物对蛋白的水解作用。本研究采用Cu2+化合物对马心肌红蛋白进行水解切割研究。实验表明，Cu2+化合物对肌红蛋白的水解具有很高的选择性，并发现一个在Cu2+化合物水解多肽及蛋白的研究中从未观察到的新的水解位点。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　LCQ电喷雾质谱仪(Finnigan MAT); MiniProtean Ⅱ电泳仪(BioRad);UV 3100紫外可见分光光度计(Shmidzu);UVP b=5∶1(摩尔比)的比例混合， 在50 ℃ 下恒温3 d，然后加入EDTA溶液终止反应。反应终止后加入360 μL标准SDS还原缓冲溶液，将混合物在95 ℃恒温5 min，然后再冷却到室温，取5 μL在BioRad MiniProtein 电泳仪上进行聚丙烯酰胺电泳。分离胶：pH 8.8，18%聚丙烯酰胺;浓缩胶：pH 8.6，7%聚丙烯酰胺。用0.1%考马斯蓝R250染色。 　　2.3 色谱质谱条件 　　Hypersil C8柱(100 mm×2.1 mm， 5 μm)，流速0.2 mL/min。洗脱液A：含0.1%三氟乙酸的水溶液;洗脱液B：含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液。洗脱梯度为60 min内从100%A到40%A+60%B。ESI离子源喷雾电压4.5 kV，毛细管温度250 ℃。ESIMS测得的原始数据通过Bioexplore软件计算蛋白和多肽片断的分子量。 　　3 结果与讨论 　　3.1 铜化合物对蛋白的水解作用 　　将肌红蛋白按实验方法分别与CuCl2，Cu(ClO4)2和Cu(AC)2在50 ℃下恒温反应3 d，聚丙烯酰胺凝胶电泳如图1。 　　图1中第1列为分子量标记，第2列是控制实验，即肌红蛋白中未加任何铜化合物，在此条件下肌红蛋白未见任何断裂现象。这表明水解反应确实是由铜化合物引起的。图1中3～5列除可观察到2个主要的片断带外，还隐约可见2个较弱的片断带。经HPLCESIMS实验证明，2个较强片断带之间以及2个较弱片断带之间互为补偿带。 　　从图1还可见，在完整蛋白带下还存在一条较浅的带，即使在新鲜配制的肌红蛋白的凝胶电泳中，这一浅带仍然存在，这是由于肌红蛋白中含有少量杂质引起的，而不