靶向ASGPR的反义核酸体外抗HBV作用.docVIP

　　靶向ASGPR的反义核酸体外抗HBV作用 【摘要】目的 研究以宿主基因ASGPR 为靶的反义核酸的抗-HBV 作用,为HBV 感染的用药提供新的思路。方法 以Hep G212115 细胞为靶细胞,脂质体为载体将靶向ASGPR 的硫代反义寡核苷酸(ASODN) 转染至Hep G212115 细胞中, 72h 后收集细胞培养液,采用酶联免疫法及荧光定量PCR 法测定细胞培养液中HBsAg、HBeAg。结果 结果表明，随着浓度的升高，ASODN抗HBsAg , HBeAg和HBV DNA的作用逐渐增强。当ASODN高于0.5μmol/L.时作用逐渐减弱。结论 ASODN具有抗HBsAg , HBeAg和HBV DNA的作用。 【关键词】 寡核苷酸 反义 乙型肝炎病毒 【Abstract】Objective To investigate the inhibitory effects against HBV of a phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotide “ASODN” targeted to ASGPR in vitro. The assay attempted to access a neethod and idea to refresh the thinking ent by the ASODN targeted to asialoglycoprotein receptor (ASGPR). Methods (ASGPR ) mRNA edia edium ined by real-time PCR. HBsAg and HBeAg ol/L. Conclusion It is concluded that under certain experimental conditions, the ASODN is a poRNA的二级结构设计并筛选出的反义寡核苷酸(anti2sense oligodeoxynucleotide, ASODN) ,能有效地抑制Hep G212115 细胞分泌的HBsAg、HBeAg、HBV-DNA[12]. ,本实验以Hep G212115 细胞为模型,观察ASODN的抗-HBV作用。 1材料与方法 1.1细胞培养　Hep G212115 细胞由本实验室保存, 用含10 %胎牛血清( FBS , Gibco) , 380μg/ ml G418 ( Promega) 的MEM 细胞培养液置37 ℃,5 %(体积分数) CO2 孵箱培养。 1.2试剂　Lipofectin 购自美国Invitrogen 公司,乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒购自华美生物工程公司,乙型肝炎病毒e 抗原诊断试剂盒购自华美生物工程公司。 1.3寡核苷酸的制备　ASODN ( 5′2 CCTCCCAGGACGT2 GACCACC23′) 由ABI8909 型自动DNA 合成仪合成并在合成时进行硫代修饰,用Micro Pure Ⅱ反向纯化柱(Oligo PrepOP120 ,SAVANT) 纯化。 1.4 HepG212115 细胞给药　在96 孔板中,每孔加入含6 ×103 个Hep G212115 细胞的100μl 的细胞培养液,置37 ℃,5 %CO2孵箱培养72h。用Lipofectin 按照其说明书进行A2SODN 转染。ASODN 终浓度为011μmol/ L 、012μmol/ L 、014μmol/ L。 分别取ASODN 的3 个浓度( 011μmol/ L 、012μmol/ L 、014μmol/ L),每个重复3 个孔。以不给药组作为空白对照组。继续培养72h后收集培养液, - 20℃保存备用。 1.5寡合甘酸药对HepG212115 细胞分泌HBsAg、HBeAg 的抑制作用检测　将收集好的培养液按照乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(华美生物工程公司) ,乙型肝炎病毒e 抗原诊断试剂盒(华美生物工程公司) 说明书操作。各取50μl 培养。液加入表面抗原及e 抗原包被的96 孔板中,再加入50μl 相应的酶标结合物,37℃孵育1h。相应洗液洗板5 次,再依次加入50μl 显色液A 及50μl 显色液B ,37 ℃避光显色15min ,最后加入50μl 终止液。在多标记酶联免疫检测仪(VIC2TORTM ultilabel Counter , g2 + ,2μl 模板,混匀后将各反应管与标准曲线反应管一起放入iCycle 自动PCR 仪中进行扩增,扩增条件为:94 ℃30s ,55 ℃30s ,72℃30s ,共40个循环,反应后由电脑自动计算出定量结果。 2结果 2.1寡核苷酸药对HepG212115 细胞分泌HBsAg、HBeAg 的抑制 2.1.1