预变性成年大鼠嗅神经后嗅球嗅鞘细胞的培养.docVIP

　　预变性成年大鼠嗅神经后嗅球嗅鞘细胞的培养 【摘要】 　　目的: 对预变性大鼠嗅神经后嗅球嗅鞘细胞的形态学及免疫组化进行研究, 探讨获取自体激活嗅鞘细胞简单而实用的方法。方法: 建立嗅神经切断模型, 大鼠(12只)均在显微镜下暴露左侧嗅球, 而预变性嗅神经组（6只）切断大鼠左侧嗅神经, 3 d后取材采用差速贴壁纯化培养方法培养嗅鞘细胞 , 在不同时间进行NGFRp75 免疫组化染色鉴定及形态学观察。结果: 嗅鞘细胞发生代偿性肥大, 数量及纯度高, 此方法成功培养出自体激活的嗅鞘细胞。结论: 预变性嗅神经是获取成年大鼠自体激活嗅球嗅鞘细胞的简单而实用的方法。 【关键词】 嗅鞘细胞; 　 预变性; 　形态学; 　嗅球 　　已证实成熟的嗅神经与其他中枢神经系统（S）不同, 主要区别是能够进行自我更新, 其新生轴突能够长入嗅球形成完整的突触功能联系［1］。主要原因是嗅觉系统含有特殊的神经胶质细胞: 嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cell, OEC)。OEC是分布于嗅觉系统嗅球和嗅上皮基底膜的一种特殊的胶质细胞。虽然OEC促进中枢神经再生机制不明, 但是已有研究表明OEC分泌许多对神经元有促进作用的营养因子（神经生长因子、 脑源性神经生长因子、 胶质源性神经生长因子、 NTN等）［2］。有研究表明切断嗅神经后再生的嗅神经能够到达嗅球建立突触功能联系, 我们主要探索在切断嗅神经后OEC是否被激活, 以便为临床应用打下基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　雄性SD大鼠 （12只, 2.5月龄）, 购自西安交通大学动物中心。CO2培养箱（美国 Thermo）、倒置显微镜（厦门Motic）、 培养板、瓶（美国康宁）、DMEM/F12培养基（Hyclone）、胎牛血清（北京鼎国）、胰酶（Solarbio）、多聚左旋赖氨酸（Sigma）、兔抗大鼠NGFRp75一抗（1∶200, 北京博奥森）、 即用型 SABC 染色试剂盒(武汉博士德) 。 　　1.2 方法 　　1.2.1 大鼠嗅神经切断术 　　雄性SD大鼠, 以100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉（3 mL/kg）后固定在立体定位仪上, 所有大鼠麻醉后在鼻额缝部位沿头颅正中切开头部皮肤、 皮下软组织及骨膜。显微镜下于鼻额缝后4 mm、 正中缝外侧2 mm处用电钻暴露左侧嗅球, 解剖显微镜下用弯曲的钝性针头沿筛板切断左侧嗅神经 (进入深度约6 mm)［3］。 　　1.2.2 差速贴壁纯化嗅球嗅鞘细胞 　　雄性SD大鼠嗅神经切断术3 d后, 显微镜下将左侧嗅球完整取下, 立即放入4℃预冷的DMEM 抗菌素液中(青霉素链霉素各100 U/L), 并将嗅球被膜剥下, 将嗅球组织在加抗生素的DME液中, 清洗2遍。将嗅球用眼科剪剪碎至1 mm2大小, 2.5 g/L的胰酶在37℃消化15 min 。用含100 mL/L FBS的DF12培养液终止消化5 min室温下800 r/min离心5 min去上清。重新加入100 mL/L FBS的DF12培养液, 用pasteur管轻轻吹打 10～20次并过200目滤网制成单细胞悬液调整密度至1×109/L, 种植于无包被处理的6孔细胞培养板内, 置于37℃、 50 mL/L CO2培养箱内培养。按经典Nash差速贴壁法在培养18～36 h 后, 将悬液细胞液吸出, 重新种植于包被多聚赖氨酸的6孔细胞培养板内, 加DFl2 (DMEM∶F12为1∶1) 完全培养液3 mL进行培养。为了便于免疫组化显微镜下观察, 可将多聚赖氨酸处理的盖玻片放入6孔板内, 在盖玻片上进行细胞培养。 　　1.2.3 形态学研究及免疫组织化学染色鉴定 　　体外培养嗅鞘细胞主要去除的是成纤维细胞、 星形胶质细胞以及少量的神经元。根据细胞形态不同和成纤维细胞和星形胶质细胞对NGFRp75染色呈阴性反应。选用对嗅鞘细胞特异性染色的NGFRp75结合形态学鉴定嗅鞘细胞及其纯度。差速贴壁后7、 14 d进行鉴定和细胞纯度计算。鉴定前24 h换液1次。细胞爬片首先经0.01 mol/L PBS, pH7.4洗2遍。新鲜配制的40 g/L多聚甲醛室温固定60 min, PBS洗3次, 每次2 min。3 g/L过氧化氢1份+纯甲醇50份, 室温浸泡30 min, 0.01 mol/L PBS洗2次, 每次5 min。2.5 g/L TritonX100 37℃孵育30 min, PBS洗3次, 每次2 min。50 g/L BSA封闭液室温20 min, 吸去多余液体, 不洗。加入适当一抗(兔抗P75NGFR, 1∶200), 湿盒内4℃下过夜, PBS洗3次, 每次2 min。加入二抗(Biotin标记的羊抗兔IgG), 37℃孵育20 min, PBS洗3次