发育生物学复习资料：实验二 石蜡切片的HE染色.docVIP

实验二 石蜡切片的HE染色 2014年 2月 8日 【实验目的】 掌握石蜡切片HE染色的基本技术。 【实验原理】 HE[Hematoxylin and Eosin]染色也称苏木精-伊红染色，是组织学技术的常规染色方法。苏木精是一种天然香料，它本身并不能染色，在经氧化后变成苏木红才是真正的染料，苏木对细胞核的亲和力并不强，而在媒染剂的帮助下才能较好显示细胞核，此时细胞核呈红色，只有在碱性环境中，苏木才变成蓝色。氧核糖核酸（DNA）两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。伊红的细胞浆的良好染料。 【预习要求】 熟悉HE染色的基本过程和原理。 HE染色中的注意事项和常见问题。 通过书籍和网络等解答思考题。 【器材与试剂】 实验器材： 镊子、染色缸、盖玻片、显微镜、上次切好的睾丸切片。 实验试剂： 各种浓度的酒精、二甲苯、苏木精染液、伊红溶液、1﹪盐酸溶液、氨水、中性树胶。常用染液的配制： ⑴．埃利希（EhrliCh）H·E染色的步骤和方法 1．染色步骤： （1）切片脱蜡：二甲苯去蜡5～10分钟，石蜡切片在温箱中烤干即可进入二甲苯脱蜡，遇室温过低时则应加温脱蜡，石蜡方能溶去，脱蜡不尽不能染色。 （2）切片从二甲苯取出，浸入无水酒精约1～3分钟，用以洗去载片上溶解的石蜡与二甲苯，此时切片应全部清晰。 （3）切片浸入95%乙醇1～3分钟，其作用与纯酒精相同，此时，组织片呈白色。 （4）浸入80%乙醇1～2分钟，逐步减低乙醇浓度，使切片不致于因高浓度乙醇骤然入水而易于脱落。 （5）切片经Lugol氏碘乙醇3～5分钟，除去组织中的汞盐沉淀。非含升汞固定液固定的组织，无需经此步处理。 Lugol碘酒精配制：碘片2克，碘化钾1克，70～75%酒精100 ml。 混合后，充分摇动，使其溶解。 （6）用普通水初步洗净碘液。 （7）浸入5%硫代硫酸钠液，洗去棕色，至切片无色，1～2分钟。 （8）切片，用普通水漂洗，然后用蒸馏水漂洗片刻，以备染色。 （9）切片入Ehrilich氏苏木精染色，此步染胞核，染色时间为10～15分钟，若室温低或新配苏木精，染色时间应适当延长，冬天则需加温染色，否则不易着色，苏木精使用过久或因与其它物质起作用发生沉淀，染液变为兰黑，则苏木精失效。 （10）用普通水洗净余染液。 （11）切片经盐酸酒精分色，此步是苏木精染色的关键，盐酸酒精配方： 盐酸HCl（浓）0.5～1 ml，70～95%酒精100 ml。 盐酸酒精分色时间视组织颜色的深浅而定，一般10～20分钟。火棉胶和冰冻切片较厚，分色时间要长些，分色要适当，必须用显微镜检查，当然经验丰富者肉眼可以判断，分色标准以核为深染兰色，胞质无色或淡灰白色为好。 （12）充分水洗，可用自来水徐徐冲洗干净，但注意冲洗时，不要直接冲到组织片上，以免切片脱落，约5～10分钟，使切片变兰色，此时用镜检查可见组织内细胞核为深兰色，用1%碳酸钡或重碳酸钠0.3克，硫酸镁2克加普通水100 ml促兰，但促兰色过度可使伊红拒染，一般只要苏木精质量好，无需用促兰溶液。 （13）接着用0.5～1%伊红水溶液染胞质，染色时间一般为3～10分钟，可视组织的性质与伊红的浓度，增减染色时间，若遇伊红染色困难，可于伊红溶液冲加冰醋酸数滴促染，伊红染色不宜过深，淡红即可，过深会掩盖兰色，使组织结构模糊。 （14）切片置于95%酒精中分色，洗除切片上多余的伊红。使胞质着色清晰，分色时间为1～3分钟。 （15）浸入95%酒精继续分色兼脱水，除净多余伊红，时间为1～3分钟。 （16）切片置于100%酒精脱水鉴别约2～3分钟。 （17）切片置于100%酒精中，以保证切片完全脱水，约有～3分钟，不可久置，久置组织会过度褪色。 （18）切片从纯酒精中取出后，用吸水纸略为吸干，立即放入二甲苯中透明，透明时间约3～5分钟，检查切片，此时切片完全清晰透亮，若切片上出现云雾状或白色说明组织切片脱水不够或在空气中吸水，应将切片返回纯酒精，复入二甲苯中直至透明为止。 （19）中性树胶封固，切片经二甲苯透明后，取中性加拿大树胶滴入载玻片的组织上，取盖玻片从一端逐步往下盖去，可避免发生气泡，另法即将树胶滴于盖玻片上，将载玻片组织面倒转向下，复盖于盖玻片上，此法较快。树胶要求中性，否则容易褪色，切片封固后，置于37℃～40℃温箱中烤干，放阴凉处保存。 （20）镜检染色结果，H·E染色结果，细胞核呈深兰色，胞质为红色，结缔组织淡红色，肌纤维红色，胶元纤维红色，软骨组织深兰色，红血球桔