发育生物学教学课件003-研究方法.pptVIP

发育生物学（Development biology） 发育生物学研究技术 鉴定可与靶蛋白结合的DNA序列; 分离结合蛋白质; 利用原位杂交技术研究基因表达的时空谱 电泳法 Western blot 抗体染色法 用组织特异性启动子控制外源基因的表达 五、发育生物学研究技术 转基因动物与基因的异位表达 DNA注射； RNA注射； 病毒感染。 Dominant Negative Receptor Mutations RNAi 研 究 史 1990，Rich Jorgensen 在矮牵牛花中发现转基因沉默 1995，researchers Guo 和Kemphues 注入反义RNA及正义链RNA都能抑制线虫par-1 基因的表达；三年后，Fire等注入双链RNA到线虫中发现比注入单链更有效，随后发展了通过RNAi进行线虫基因敲除的策略。 2001年Elbashir等《 Nature》上首次报道通过21个核苷酸的siRNA成功地在哺乳动物培养细胞中诱导特异性基因沉默。随后，在小鼠等多种细胞中也取得了成功。2002---载体 化学合成 体外合成siRNA对应的DNA发卡模板 siRNA进入细胞（转染） siRNA设计 siRNA合成 体外转录合成 siRNA标记 模板构建到载体 质粒进入细胞（转染，转化） 检测（核酸，蛋白质水平） 目的基因片段的PCR扩增 PCR产物转录为RNA长片段 RNase III消化 体外转录合成SiRNA U6/H1-siRNA 表达载体的构建 Tandem Type Hairpin Type GN17C TTTTT U6 P U6 P GN17C TTTTT GN18-loop-N18 U6 P TTTTT Sense antisense antisense Sense GN17CU4 4UCN17G 转录 退火 siRNA GN18 4UCN18 GN18NN 4UCN18 转录 Dicer siRNA 细胞膜 受体胞外区 受体跨膜区 突变 受体胞内区缺失导致信号传导的中断 受体胞内区 配体 配体 下游信号分子 蛋白以及蛋白之间的相互作用决定了蛋白的生物学功能及细胞的表型.??一种结构发生变化而失去其正常的生物学功能的蛋白质分子，往往与其相应的野生型蛋白进行竞争性的抑制，从而阻断野生型蛋白的生物学功能.??这种具有竞争性抑制野生型蛋白分子生物学功能的突变体称为显性抑制突变体(dominant??negative??mutant). 胚胎培养与胚胎干细胞 发育生物学研究技术 Department?of?Developmental?BiologySchool of Life Sciences Central?South?University zhangjianxiang@csu.edu.cn 发育生物学研究技术 根据研究目的不同，采用的技术发法也不同。大致可以分为以下几个方面： 形态学研究技术 发育机理研究技术 遗传学研究技术 生殖技术 形态学研究技术： 主要用于生物发育过程中的形态结构观察与组织结构演变规律及细胞迁移等研究。 包括光镜技术、电镜技术、组织细胞培养技术、组织化学技术、原位杂交技术、细胞移植技术等。其中包含了染料细胞标记、荧光细胞标记技术。 发育机理研究技术 发育机理研究，主要是发育控制基因的鉴定、表达和功能检测。 研究方法主要是分子生物学技术 从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因； 分离时空特异性表达基因的方法； 利用基因序列同源性的克隆法； 利用生物大分子间的相互作用克隆新的基因。 （一）、鉴定发育相关基因的主要方法 （二）、基因表达的检测 mRNA的检测 蛋白质的检测 启动子活性检测 （三）基因对发育的影响的功能性研究 1. 基因敲除(gene knockout) 2. 转基因 3. Antisense RNA 4. DsRNA interference (RNAi) 5. Antibody blocking 6. Dominant negative receptor mutations 遗传学研究技术 主要由于物种遗传信息、生物进化、遗传性疾病与畸形等基因分析。 常用染色体技术与基因扫描技术 生殖技术 属于应用技术，主要由于物种改良、辅助生殖。如人工授精技术、物种间杂交技术等。 （一）传统的发育生物学研究技术 2、基因表达的检测 从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因； 分离时空特异性表达基因的方法； 利用基因序列同源性的克隆法； 利用生物大分子间的相互作用克隆新的基因。 1、鉴定发育相关新基因的主要方法 （二）控制发育的基因的鉴定及其表达和功能检测方法 1、染料细胞标记 2、荧光细胞标记 3、细 胞 移 植 (一)传统的发育生物学研究技术