扬子鳄SRAP—PCR反应体系的优化及引物筛选.pdfVIP

维普资讯 第 31卷 2期 安 徽 师 范 大 学 学 报 (自然科学版) JournalofAnhuiNormalUniversity(NaturalScience) Vo1．31No．2 2008年 3月 Mar．2008 扬子鳄 SRAP—PCR反应体系的优化及引物筛选 田明礼， 吴孝兵 (安徽师范大学 生命科学学院，安徽 芜湖 241000) 摘 要：以扬子鳄总DNA为材料，对影响SRAP—PCR的Mg2、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物 浓度等因素进行了优化，分析了TaqDNA聚合酶、样本浓度、Mg2浓度、dNTPs浓度以及引物浓 度对SRAP—PCR扩增结果的影响．筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SRAP引物 I3对，建立了 稳定的、可重复的扬子鳄 SRAP—PCR最佳反应体系及 PCR扩增参数．研究结果表明：在 30．／1 SRAP—PCR反应体系中，样本最适宜为 1I(30ng I)，Mg 的最适为2／,1(2．5mmol／L)，dNTPs最 适为2I(2．5mmol／L)，单引物的最适均为 1*／1(10pmol I)；聚合酶在 30．／1反应体系中宜加入 1U． SRAP—PCR引物筛选及其反应体系的建立，为今后利用SRAP标记技术开展扬子鳄种群的分子 生物学研究提供 了一个标准化程序和强有力的工具． 关键词 ：扬子鳄 ；SRAP标记 ；引物；反应体系 中图分类号：Q953 文献标识码 ：A 文章编号：1001—2443(2008)02—0163—05 扬子鳄(Alligatorsinensis)是中国特有的珍稀爬行动物，为保护这一珍稀物种，我国于20世纪80年代 初，开始扬子鳄人工繁殖研究，并取得了巨大成功[，饲养种群数量逐步上升、为了较全面的了解扬子鳄遗 传资源现状，给扬子鳄保护提供必要的理论依据，一些学者曾用AFLP[、RAPD[引、SS J和mtDNA序列分 析[5]等分子标记手段对扬子鳄饲养种群的遗传多样性进行了研究，但至今尚未见 SRAP(SequenceRelated AmplifiedPolymorphism，序列相关扩增多态性)分子标记技术应用于扬子鳄研究的报道． 目前基于PCR的分子标记技术主要应用的有RAPD、SSR、1sSR、AFLP．这些标记虽各有特点，但是均 不理想．RAPD操作简便，但稳定性重复性差，而且产率低；SSR扩增得到的多为共显性标记，但是其引物开 发费时昂贵；AFLP以其精确有效得到了广泛的应用，但是复杂的步骤和昂贵的成本成为限制因素．一种新 型的基于PCR标记技术 SRAP可 以弥补 以上各项技术的不足之处．既具有 RAPD标记 的随机性和方便性， 又具有 AFLP的多态性高、可靠性好，重复性高的特点．Budak等 【]以野牛草为材料比较了RAPD、SSR、 ISSR和SRAP4种分子标记技术，发现SRAP有最丰富的多态性和最强的区分能力；在南瓜中，Ferriol等¨J 从SRAP中获得的信息同AFLP相比与形态标记和进化历史更吻合；Riaz等_l8J发现SRAP标记在桃和油桃 品种鉴定中比SSR标记更有效；Ruiz等_l9]发现，SSR分析检测不出番茄种 内的变异，SRAP却可以检测出． SRAP标记最早是在芸薹属作物中开发利用，目前已在马铃薯、水稻、莴苣、花椰菜、油菜、大蒜、棉花等 植物中应用，用于遗传多样性分析、比较基因组学、图谱构建等方面[加]，在国外应用较多_l6，7,ll一14]，国内很 少，尤其在动物方面，国内外都很少报道，国内仅见一篇关于虾的文章¨51． 因此，建立和优化扬子鳄SRAP引物筛选及反应体系，为开展扬子鳄遗传多样性研究和种质资源鉴定等 提供新的理论依据，从而促进扬子鳄保护生物学的深入研究． 1 材料与方法 1．1 样 品采集与DNA提取 样品来 自安徽宣城扬子鳄繁殖研究中心和浙江长兴繁育中心，所选样品如表 l所示．采用非损伤性取样 法采其尾部静脉血液5ml，～80C保存于安徽师范大学生命科学学院保护生物实验室样品