胆固醇配基色谱在蛋白质复性中的应用.pdfVIP

中文摘要 色谱复性是一种非常有效的蛋白质复性方法，尺寸排阻色谱、离子交换色谱、 亲和色谱已经成功应用于很多蛋白质的复性中。原则上疏水作用介质能够捕捉具 有暴露疏水部位的变性蛋白质和折叠中间体，从而抑制聚集发生，也可以应用于 蛋白质复性。但商业化的疏水介质一般是针对于蛋白质分离而开发的，其疏水作 用较强，不利于蛋白质的复性。因此有必要开发一种具有适当疏水强度的色谱介 质，在抑制分子间聚集作用的同时又不会影响复性过程中的疏水塌缩，更好地实 现复性。 CL-6B介 本文以三聚氯氰为连接臂，通过两步法将胆固醇修饰31USepharose 质上，合成出一种新型的疏水介质，构建了胆固醇配基色谱。在此基础上，选取 还原变性的溶菌酶(Lys)为目标蛋白质，考察了稀释复性、胆固醇配基色谱穿 过复性和吸附一洗脱复性这三种不同方法对复性效果的影响，研究结果表明：当 上样量为0．25 mgLys／ml介质时，采用吸附一洗脱方法可最终得到96．3％的蛋白收 率和91．4％的活性收率，大大高于其它两种方法。圆二色光谱、荧光、HPLC检 验结果进一步证明了该方法所得复性溶菌酶结构的正确性。 在确定了疏水环境下吸附一盐酸胍梯度洗脱复性方法后，本文系统研究了流 速、洗脱方式、胍梯度、上样浓度、上样量等操作条件对复性系统的影响。研究 结果显示：在0．02ml／min操作流速下用0．2柱体积(CV)盐酸胍梯度进行洗脱， 即使上样量达到1mg／ml，活性收率仍能达到85％。说明该方法能高效的实现蛋 白质复性，有潜在的应用价值。 关键词：复性胆固醇配基色谱溶菌酶疏水相互作用 ABSTRACT Utilizationof columnsfor isa chromatographicprotein strategy． refoldinggood Size-exclusion and affinity chromatography，ionexchangechromatography have refolded chromatographysuccessfullymanyproteins．In to available interaction canbeusedassist hydrophobicchromatographyOaIc)media becausethe interactionbetweenHIC and proteinrefolding hydrophobic ligands denaturedaswellas intermediatesminimize proteins refolding likely aggregate． availableHIC-assisted aboutthe However，commercially refoldingmaybring that ofHICmediaofrelative viewof problemhydrophobicligands highdensity，in thecommercialto for leadtofo