人Elp3在毕赤酵母中的分泌表达及HAT活性测定.pdfVIP

第 4O卷 第 2期 河南师范大学学报 (自然科学版) vfJ．40 No．2 2012年 3月 JournalofHenanNormalUniversity(NaturalScienceEdition) M ar．2012 文章编号 ：1000—2367(2012)02—0132—05 人Elp3在毕赤酵母中的分泌表达及HAT活性测定 胡岩岩 ，李玉会 ，白 雪 ，陈百宝 ，刘呜宇，李 芬 (1．河南师范大学 生命科学学院，河南 新乡 453007；2．河南省项城市公疗医院，河南 项城 466200) 摘 要 ：人Elp3蛋 白(humanElongatorprotein3，hElp3)是组蛋白乙酰转移酶 (Histoneacetyltranferase， HAT)Elongator复合物的催化亚基 ，可参与组蛋 白乙酰化修饰与基 因转录延伸，其功能异常与人类多种疾病相关 ． 目前对其羧基末端高度保守的第二功能域研究较少．以pYES2hElp3质粒为模板 ，PCR获hElp3基因全长 ，插入改造 的毕赤酵母表达载体 pPIC9KH，转化 巴斯德毕赤酵母菌 GS115菌株．经表型鉴定、PCR分析和 G418筛选得到 Mut型多拷贝整合菌．0．5 的甲醇诱导 hElp3高效分泌表达 ，Ni-NTA纯化及 Western印迹证实获 目的蛋 白．OPA 法测得其拥有 良好的HAT活性，为体外测定其第二结构域是否拥有催化活性奠定了基础，对筛选抑制其 HAT活 性的小分子药物用于疾病治疗研究至关重要． 关键词 ：Elp3；毕赤酵母；分泌表达；活性测定 中图分类号：Q291 文献标志码 ：A hElp3(humanelongatorprotein3)拥有组蛋 白乙酰转移酶活性，属于GNAT家族 ，是Elongator复合物 的催化亚基_1]．该酶及其所在的复合物在古细菌到人之间的生物中均高度保守 J．研究表明hElp3在细胞核 和细胞质中均有分布_3]，在核中它可通过对组蛋 白H3的第 14位，H4的第 8位赖氨酸进行乙酰化修饰而参 与转录调控 ]；在胞质 中的Elp3可参与极性运输_l5]，tRNA 的修饰_6等多种重要生物学过程．已证 明Elp3 能与裸露和核小体中的DNA 及新生的mRNA结合 ；还可乙酰化胞质中的微管蛋白，暗示复合物在细胞 骨架动力学方面可能有新的作用[8 ；生物信息学分析及研究均表 明Elp3亚基 中还有 1个 SAM Radical Superfamily家族成员相似的结构域 ，该结构域中的铁硫簇能够结合 S一腺苷甲硫氨酸，可能在去甲基化反应 中发挥作用 ，因而认为 Elp3除了HAT活性外 ，可能还具有一个未知功能的催化结构域n ¨]．但 Green— wood等人认为 Elongator无生物信息学推测的组蛋白去甲基化酶活性 ，其第二结构域 中的FeS簇为 Elon— gator保持结构完整性所必需口 ．因此 目前对 Elp3是否具有组蛋 白去甲基化酶活性 尚不确定．表达纯化该 蛋白进行体外酶活测定是确定该蛋白有无组蛋白去甲基酶活性的一条有效途径． 毕赤酵母表达系统是近年来建立起来的一种较为完善的外源基 因真核表达系统 ，成功地表达了大量外 源重组蛋 白．它既具有原核表达系统繁殖迅速、费用低廉及操作方便、易于高密度发酵的特点；又具有真核表 达系统能对表达的蛋 白进行正确加工、折叠及适度糖基化 ，使表达的蛋 白具有天然生物学活性等优点；因此 已越来越广泛地用于蛋白质的大量表达．本实验选用毕赤酵母表达系统成功地实现了hElp3的高效分泌表 达 ，OPA法测定组蛋 白乙酰转移酶活性表明，得到的hElp3蛋白具有较好 的生物活性，为体外测定 hElp3是 否拥有组蛋 白去甲基化酶活性奠定了基础． 1 材料和方法 1．1 菌株、质粒、工具酶及试剂 含 hElp3全长的pYES2一hElp3质粒及 E．coliDH5a菌株为本室保存 ，酵母分泌型表达载体 pPIC9KH 收稿 日期 ：2011—09—30 基金项 目：国家 自然科学基金；河南省重点科技攻关 (O921O231OO26)；河南省重点学科建设项 目资助 作者简介：胡岩岩(1986一)，女，河南漯河人 ，河南师范大学硕士研究生 ，研究方 向：基因