波尔山羊亚种间体细胞克隆——核及胞质相容性对克隆胚胎发育影响的研究.pdfVIP

摘要 摘要 核移植(NuclearTransfer，NT)是研究细胞核与细胞质(简称核质)互 作关系中诸多问题的有效方法之一。波尔llJ羊和奶用萨能奶I|j羊虽同属山羊品 种，但他们因地域性隔离，并经长期育种，己分别成为世界公认的优质肉用山 羊和优质奶IlI羊，在亲缘关系上相差甚远。尽管这两种Ill羊自然交配可以产出 杂交后代，但应用波尔IJI羊的体细胞(供核细胞)与去核的萨能奶III羊MII期卵 母细胞(受体细胞)组成的重构胚胎至今未有成活的克隆个体出生的报道‘。另 外，在种问／亚种间克隆中，核质亲缘关系是否会对克隆胚胎的发育潜力产生影 响已成为关注的问题，目前尚未获得明确的结论。因此，本文主要从以下三个 方面来研究弧种间体细胞核移植(SomaticCellNT，SCNT)： 一、供核细胞的体外再饥饿对核移植重构胚着床前后发育的影响。本试验 主要对奶L【l羊供核体细胞的饥饿与保存等前处理条件进行研究，以获得较高克 隆成功率的供核细胞，为后续试验不同种类供核细胞的前处理建立最佳的试验 条件。本研究将山羊胎儿成纤维细胞经饥饿培养(含0．5％FCS的DMEM)2天后 一80℃或液氮冻存，试验前将该细胞复苏后进行如下三种方法的处理：复苏该细 天后，饥饿培养2天用作供核细胞(试验组II)：复苏后恢复培养2-5天，饥饿 2天后再次恢复培养2—5天，再次饥饿培养2天后用作供核细胞(试验组III)。 流式细胞分析结果显示供核细胞经过两次以上连续饥饿后，能显著提高GO／G1 期细胞的比例，但三次饥饿导致捌亡细胞比例增加：试验组II、III所用供核细 胞中GO／G1期细胞所占比例均显著地高于试验组I(分别为88．7％、95．7％VS．． I和II。用试验组II、III组细胞所组建的NT胚具有较高的囊胚发育率和受体妊 娠率：试验组II、III的囊胚期NT胚胎的发育率均分别显著地高于试验组I 发情的受体后，试验组II、III的受体早期妊娠率也均分别显著高于试验组I 验组II，但试验组III中约一半的细胞为凋亡细胞，冈此试验组III的供核细胞产 摘要 果表明供核细胞的两次饥饿是一种较好的供核细胞处理方法，并己成为本实验 室供核细胞处理的常规方法。 二、波尔JlI羊弧种间体细胞克隆的研究。基于波尔山羊和萨能奶I|I羊这两 种弧种间SCNT尚未获得克隆后代，对此，我们作了两个层次的]二作。第一，把 彳i同年龄波尔lII羊的成纤维细胞移植到去核的萨能奶l_II羊MII期卵母细胞，探索 Ⅱ种间克隆效率是否和供核波尔羊的年龄有关。结果表明，采用3岁和9岁波 尔羊成纤维细胞构建的弧种间SCNT胚胎早期妊娠虽可分别达到45．6％和28．6％， 但均无克隆后代出生，唯有2月龄波尔IJI羊成纤维细胞构建的亚种间SCNT胚胎， 早期妊娠率达到50％，但最终仅l头克隆后代存活。这一结果证实，距种间的核 移植是可以获得克隆后代，但着床后克隆胎儿丧失率极高，克隆效率很低(仅 2．8％)，克隆效率受供核羊的年龄影响。第二，把2月龄波尔IJJ羊的成纤维细胞 移入杂交Fl代羊(萨能奶IIJ羊早×波尔羊古)的去核MII期卵母细胞，并以萨 能奶ElI羊的同种核移植作对照(即奶III羊成纤维细胞移入奶t1．I羊去核的MII期卵 母细胞)。结果显示，尽管波尔山羊成纤维核移入杂交F1代羊的去核卵母细胞 的重构胚克隆效率为5．5％，较之同种克隆效率(11．43％)要低，但较上述第一 个层次的亚种间克隆效率(2．8％)高出1倍。该结果揭示了核质之间的亲缘关 系的相容性对克隆胚胎的着床后发育潜力具有重大影响。 三、核质亲缘相容互补性对亚种间体细胞克隆胚胎着床后发育率的影响。 本试验是在上述实验结果的基础上进一步验证不同亲缘水平的核与胞质的相容 性对亚种间SCNT胚胎发育率的影响。本研究构建了6种核质问4；同相容性的 SCNT胚胎来比较核质相容互补性对克隆效率的影响。其中，以波尔羊成纤维细 胞作供核细胞，以去核的萨能奶IJf羊(见二)、杂交Fl代羊(萨能奶lII羊早× 波尔IlI羊杏，见二)以及波尔|Ij羊等的卵分别作为核的受体细胞，构建了3种 SCNT胚胎：又以萨能奶Il—I羊卵作为核的受体细胞，以萨能奶1I—I羊、杂交F1代羊 (萨能奶LlI羊早×波尔J1．1羊6)、杂交F2代羊(杂交F1羊早×波尔III羊6)的 成纤维细胞分别作为供核细胞，构建了3种SCNT胚胎。结果显示，这