蛋白质分子基础2-蛋白质制备.pptVIP

蛋白质分子基础 第二章: 蛋白质的制备 本章主要内容 1.蛋白质分离纯化的一般程序 2.蛋白质的粗分离 材料的选择和细胞抽提液的制备 蛋白质的浓缩和脱盐 沉淀法分级蛋白质 3.蛋白质的层析分离 原理,离子交换、凝胶过滤、亲和层析等 4.蛋白质的电泳分析 原理、类型、聚丙烯酰胺电泳等 本章主要内容 5.蛋白质的结晶 原理、条件、方法 6.提纯过程中的定量 双缩脲法、福林试剂法、紫外吸收法、考马斯亮蓝染色法 7.蛋白质的纯度标准 电泳法、免疫化学法等 8.蛋白质的大规模分离纯化 蛋白质来源及释放、分离和浓缩、大规模层析与电泳。 第一节 蛋白质分离纯化的一般程序 1.生物组织的机械破碎:研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等(细胞外分泌物无需破碎)。 2.根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提。 水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提， 酸性蛋白用稀碱性溶液抽提， 脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。 3.离心:去亚细胞颗粒、细胞碎片等 4.粗提: 离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。 5.精制：可用层析法、电泳法等进行精制。 6.结晶：取得蛋白质晶体并测定蛋白质的性质。 蛋白质分离的注意事项 要建立一个方便灵敏的分析方法。 要选择一种最好的含有目的蛋白质的材料 分离步骤要尽可能少 尽量避免蛋白质在提纯中的变性。 低温（40C）、蛋白质酶抑制剂 巯基试剂（二硫苏糖醇）可防止半胱氨酸的氧化。 金属螯合剂（EDTA等）可防止重金属离子对酶的失活作用。 第二节 蛋白质的粗分离 材料的选择和细胞抽提液的制备 蛋白质的浓缩和脱盐 沉淀法分级蛋白质 (一)材料的选择 材料选择的原则 目的蛋白质的含量要高 容易获得 不同种属和个体会有差别 动物：性别、年龄、季节、生理条件不同，蛋白质在质和量上会有区别 植物：不同组织、器官、不同发育阶段、有外来病理侵袭时各不相同。 注意:取材后立即使用或置-10?-50℃保存备用。 二、细胞破碎方法及细胞提取液的制备 破碎细胞的方法 温和方法 较剧烈方法 剧烈的方法 温和方法 细胞溶解 红细胞，渗透压破碎细胞膜 酶降解 溶菌酶处理细菌，消化细胞壁 化学溶解/自溶 甲苯抽提酵母，部分溶解细胞壁 手动匀浆器 肝组织，迫使细胞通过窄隙撕开细胞膜 研磨 肌肉等，研磨产生的切割力破坏细胞 较剧烈方法 韦林氏捣切器（waring型） 大多数动物组织和植物组织 切削作用和剪切力 磨料研磨（砂、氧化铝） 植物组织与细菌，微小粗糙表面破坏细胞壁 剧烈方法 压榨机（french press） 迫使细胞在高压下通过小孔，剪切力破坏细胞 细菌和植物细胞 超声作用 剪切力和空化作用破碎细胞 细胞悬浮液 震动玻璃球(直径0.5~1 mm) 与玻璃珠一起快速震动，撕开细胞壁 细胞悬浮液 研磨机 迫使细胞在高压下通过小孔，剪切力破坏细胞，大规模操作。 作用于悬浮液 抽提缓冲液的提取 尽量使用类似于生理条件下的缓冲液，常用的缓冲液有： 20~50 mmol/L的磷酸缓冲液，pH7.0~7.5； 0.1 mol/L Tris-HCl ，pH 7.5； 缓冲液中可加入EDTA（1~5 mmol/L）或者蛋白质稳定剂等。 其他注意事项 动物组织和器官要尽可能除去结缔组织和脂肪。 制备植物细胞时，在缓冲液中加入聚乙烯吡咯啉酮(PVP)可以减少褐变, 它可以吸附多酚化合物。 革兰氏阳性菌可用溶菌酶消化，370C处理15分钟即可溶解细胞壁。 革兰氏阴性菌较难消化。可先用非离子去污剂（如Triton X-100）、巯基乙醇或甘油处理细胞。在溶液中还可加入脱氧核糖核酸酶I（10 ug/mL），可以使溶液的黏度降低，可以提高抽提液的质量。 三、膜蛋白的释放 膜蛋白存在于细胞膜或各种细胞器当中(叶绿 体、线粒体、内质网、或细胞核） 外周蛋白 通过静电力或共价键和外膜脂质的极性头部螯合在一起。 占膜蛋白的20~30% 内在蛋白（固有蛋白） 嵌合在膜脂双层结构中。 大部分膜蛋白是固有蛋白 生物膜的功能 生物膜研究的意义 外周蛋白 外周蛋白的分离 改变离子强度 金属螯合剂（EDTA）可将其抽提出来 膜内在蛋白的提取 提取的原则 抽提膜蛋白时，首先削弱膜蛋白和膜脂的疏水