盐溶蛋白电泳技术及其在玉米种子鉴定中应用.doc

盐溶蛋白电泳技术及其在玉米种子鉴定中应用摘要:盐溶蛋白电泳方法具有样品提取时间和电泳时间短、电泳谱带清晰、分辨率高、品种间谱带差异大、组合间互补带明显等优点,因而在玉米种子纯度鉴定中具有重要意义。文章综述了盐溶蛋白电泳技术检测玉米种子纯度的原理、操作要点、谱带分析及在电泳过程中常出现的问题及解决办法,旨在为从事种子鉴定的工作者提供参考。 关键词:盐溶蛋白;蛋白质电泳技术;种子纯度鉴定 中图分类号:S513 文献标识码:A 文章编号:1674-0432(2010)-07-0042-2 0 前言 随着新育种方法的广泛应用以及种子加工业对种子质量的特殊要求,传统的形态学检验方法已不能满足种子生产、运输和加工各个环节对检验的要求,迫切需要新的精确的检验手段的应用。上个世纪70年代以来,蛋白质电泳技术开始应用于种子品种鉴定和纯度检验,并得到迅速推广。1991年,国际种子检验协会把蛋白质电泳方法正式定为标准的品种鉴定方法,从而使蛋白质电泳技术在种子品种鉴定和纯度检验上占有重要地位,对防止伪劣种子流入市场同时保护优良种质防止良种退化,维护育种家们的知识产权和权益等方面具有重要意义。 随着电泳技术的迅速发展,玉米种子纯度盐溶蛋白质鉴定方法于2001年9月被列为行业标准,使得应用蛋白质电泳鉴定种子纯度的技术得到迅速普及。盐溶蛋白电泳方法具有样品提取时间和电泳时间短、电泳谱带清晰、分辨率高、品种间谱带差异大、组合间互补带明显等优点。 1 盐溶电泳技术的原理 从玉米种子中提取的盐溶蛋白在聚丙烯酰胺凝胶的浓缩效应、分子筛效应和电泳分离的电荷效应作用下进行分离,通过染色显示蛋白质谱带类型。不同玉米品种由于遗传组成的不同,种子内所含的蛋白质种类有差异,这种差异可利用电泳图谱加以鉴别,从而对种子真实性和品种纯度进行鉴定。 2 盐溶电泳技术的操作要点 2.1 样品制备 按GB/T3543.2的要求,从送验样品中随机分取玉米种子至少100粒,用单籽粒粉碎器粉碎,放人1.5ml离心管中,用滴管加入与样品体积相同的样品提取液,摇匀,放置5min后,再摇一次,30min后,用离心机离心(5000r/min)15min,取上清液用于电泳。 2.2 凝胶制备 2.2.1 胶室制备 将预先洗净晾干的玻璃板装入胶条中,然后把胶条固定在垂直板电泳槽内,保持水平,短板向正极,拧紧螺栓,备用。 2.2.2 封底缝 根据电泳槽大小,取适量分离胶溶液于烧杯中,用微量进样器加入适量3%的过氧化氢溶液(一般每5ml分离胶溶液加20μl3%过氧化氢溶液),迅速摇匀,并从长玻璃板外侧沿玻璃板倒入,振动电泳槽3次,放平。 2.2.3 灌分离胶 底缝封住后,用滤纸条插入两玻璃板之间,吸去因聚合而析出的水;量取分离胶溶液适量,加入3%过氧化氢溶液(一般每15ml分离胶溶液加3%过氧化氢20μl)迅速摇匀;倾斜电泳槽,将分离胶溶液倒人两玻璃板之间,高度距短玻璃板上沿1.2cm;放平电泳槽并在试验台上振动3次后,迅速加入适量的正丁醇封住胶面。待凝胶聚合后,吸出分离胶表面上的正丁醇,并用去离子水冲洗胶面3次,用滤纸吸干。 2.2.4 灌浓缩胶 量取浓缩胶溶液适量,加入3%过氧化氢溶液(一般每5ml浓缩胶溶液加3%过氧化氢溶液40ul),迅速搅匀,倒入两玻璃板之间,马上插好样品梳,样品梳底部距分离胶顶部0.5cm。 2.3 点样 浓缩胶聚合后,拔出样品梳并将样品槽清理干净,用微量进样器在每个样品槽中加入不同籽粒的样品上清液15ul,每点一粒后,都要用去离子水清洗进样器3次。 2.4 电泳 加样完毕后,倒人电极缓冲液,上槽电极缓冲液面要高于短玻璃板,下槽电极缓冲液面要高于铂金丝;将电源线正极接上槽,负极接下槽;接通电源,采用500V稳压进行电泳,待甲基绿指示剂下移至胶底部边缘时,关闭电源。 倒出电极液,从电泳槽内取出胶室,卸下胶条,启开玻璃板,取出胶片,浸入染色液中。 2.5 染色 在30℃恒温条件下染色2-4h。之后取出胶片,用0.5%的不加酶洗衣粉水洗净。 2.6 结果计算 2.6.1 电泳测定值计算 待整个供检样品电泳结束后,在观片灯上鉴定胶片上电泳谱带的特征和一致性,计数供检样品粒数和非本品种粒数,并按公式[X(%)=100×(供检样品-非本品种颗粒)/供检样品粒数]计算电泳测定值X。 2.6.2 样品纯度值计算 将电泳测定值X代人公式Y=52.9+0.461X,计算出样品纯度值Y,再将Y与GB4404.1中的纯度值进行比较,判定样品是否合格。 3.盐溶蛋白质电泳常见谱带分析法 3.1 根据谱带特征、血缘关系和鉴定方法分类 可将谱带