串联亲和纯化技术筛选手足口病病毒ev71 3d蛋白 - 第三军医大学学报.docVIP

串联亲和纯化技术筛选肠病毒71型 3D聚合酶的相互作用蛋白 江月1,2，丛浩龙2，王健2，李梨1（400016 重庆，重庆医科大学：生物化学与分子生物学教研室1；100101 北京，中国科学院微生物研究所2） [摘要] 目的 利用串联亲和纯化技术筛选与肠病毒71型3D聚合酶相互作用的宿主细胞蛋白。方法 利用RT-PCR方法从EV71BrCr株全基因组中获得3D聚合酶全长基因，构建pcDNA3.0-3D-Flag-HA真核表达载体并转染RD细胞，48h后收集细胞。用Western blot方法检测3D蛋白在RD细胞内的表达情况。串联亲和纯化技术筛选与3D聚合酶相互作用的宿主蛋白并进行质谱分析, 确定与3D聚合酶相互作用的蛋白或多肽。并采用免疫共沉淀实验，对候选蛋白CyclinG1与3D的相互作用进行验证。结果 成功构建了pcDNA3.0-3D-Flag-HA载体，在RD细胞内检测到3D蛋白的表达。经串联亲和纯化和质谱分析得到LATS2、Nek2、APC5、Cyclin-G1、PI3K等一系列参与细胞凋亡及细胞周期调控的蛋白。免疫共沉淀实验证实3D蛋白与CyclinG1的相互作用。结论 3D聚合酶可能与宿主细胞内蛋白相互作用，引起细胞凋亡及细胞周期改变。 [关键词] 肠道病毒71型；3D聚合酶；串联亲和纯化；液相色谱-质谱分析法 [中图法分类号] Q71; Q291;