纳升电喷雾毛细管液相色谱-串联质谱鉴定k562 细胞株中混合蛋白质.pdf

第33 卷 分析化学 （FENXI HUAXUE ） 研究报告 第11 期 2005 年11 月 Chinese JournaI of AnaIyticaI Chemistry 1547 ~ 1550 纳升电喷雾毛细管液相色谱- 串联质谱鉴定 K562 细胞株中混合蛋白质 蒙 根 王海龙 刘炳玉 王鸿丽 李卫华 王红霞 魏开华＊ 张学敏 杨松成 （军事医学科学院国家生物医学分析中心，北京 100850 ） 岑 坚 （海军总医院血液科，北京 100037 ） 摘 要 用标准蛋白质混合物建立了一种适用于低丰度混合蛋白质及其异构体分离与鉴定的蛋白质组学方 法。通过IPG 胶条等电聚焦分离蛋白质，染色后进行混合胶内酶切，采用纳升电喷雾毛细管液相色谱- 串联质 谱“散弹法（shot-gun ）”分析酶切产物，并进行数据库检索鉴定蛋白质。运用该方法从K562 细胞株样品中鉴 定出14 种具有重要功能的蛋白质，部分蛋白质同时在多个条带中出现，可能是异构体。肽段及其碎片离子的 平均质量偏差小于0 . 05 U ，综合得分大都远远超过有效值。该方法灵敏、准确度高、分辨率高、省时、便于操 作，在鉴定蛋白质异构体方面有优势。 关键词 等电聚焦，散弹法，蛋白质组学，串联质谱，K562 细胞株 1 引 言 双向电泳在蛋白质组学研究中得到普遍应用。但该技术仍存在一些不足，如对一些疏水性的膜蛋 白和极酸性、极碱性以及分子量极大或极小的蛋白质分离较困难，使许多有生物功能的蛋白质分子被忽 略掉［1］。为了弥补双向电泳的局限，本实验建立了一种基于一维固相pH 梯度等电聚焦电泳（Immobi- Iized pH gradient isoeIectric focusing ，IPG IEF ），结合串联质谱技术的混合蛋白质鉴定方法。采用IPG IEF 进行蛋白质分离，然后进行混合胶内酶切，采用纳升电喷雾毛细管液相色谱- 串联质谱“散弹法 （shot-gun ）”进行蛋白质鉴定，结果显示本方法分辨率高，在鉴定蛋白质异构体方面有一定的优势。 K562 细胞是一株分化差、恶性程度高的人白血病细胞。是白血病研究中重要的模型细胞。近年 ［2 ，3 ］ 来，双向电泳技术研究K562 细胞耐药后蛋白的改变和K562 细胞凋亡的蛋白质组的报道很少 ，主要 是用肽质量指纹谱鉴定几个差异蛋白质。 ［4 ］ Le Bihan 等 用二维色谱-质谱技术分析了K562 细胞总蛋白 提取物，鉴定了25 个蛋白。本实验对K562 细胞总蛋白提取物等电聚焦的24 个蛋白条带中5 个条带进 行了分析，鉴定了14 个可能与白血病相关的重要蛋白质，其中10 个蛋白与该文献相同。 2 实验部分 2 . 1 仪器和试剂 固相pH 梯度等电聚焦电泳仪IPGphor IEF System（Amersham Biosciences 公司）；纳升电喷雾毛细管 液相色谱- 串联质谱（NanoSpray CapLC MS/ MS ）为英国Micromass 公司的O-TOF2 ；基质辅助激光解吸电 离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS ）为 AutofIeX （Bruker 公司）；真空干燥器（Centrivap Concentrator LABCONCO ，USA ）；固相pH 梯度干胶条（IPG strip ，pH 3 ~ 10 ，24 cm ）、覆盖液均为Amers