结核分枝杆菌早期培养滤液蛋白的制备和应用 - 中国医药生物技术.pdf

中国医药生物技术 2012 年 6 月第 7 卷第 3 期 Chin Med Biotechnol, June 2012, Vol. 7, No. 3 229 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.03.014 ·技术与方法· 结核分枝杆菌早期培养滤液蛋白的 制备和应用 都伟欣，杨蕾，苏城，沈小兵，徐苗，卢锦标，王国治，陈保文 全球结核杆菌感染者高达 20 亿人，每年新发病例约 内，4 ℃，8000 r/min，离心 30 min ，离心结束后弃去菌体， 800 万 ~ 1000 万，其中我国每年新发患者高达 150 万。 收集培养上清。将培养上清过 0.22 μm 滤膜除菌。将除菌 结核杆菌流行病学的一个重要特征是结核分枝杆菌的潜伏 过滤后的培养上清置于超滤离心管中进行超滤离心，4 ℃， 感染。结核分枝杆菌潜伏感染是一种亚临床状态，其中约 4000 r/min ，控制离心时间使培养上清浓缩 10 倍；然后补 有 10% 的结核分枝杆菌潜伏感染者会发展成为结核病患 加磷酸盐缓冲液至初始体积，相同条件再次进行超滤离心浓 者[1] 。流行病学调查显示，我国受结核杆菌感染人数超过 缩，步骤重复 3 次，将培养上清中的培养基成分去除，置 5 亿。因此，如何有效、全面地筛查出结核病患者和结核杆 换成磷酸盐缓冲液；最后浓缩得到的蛋白即为早期培养滤液 菌潜伏感染人群，是结核病控制首要解决的问题。结核分枝 蛋白，以 Lowery 法测蛋白浓度进行定量。 杆菌早期培养滤液蛋白主要为小分子的分泌性蛋白，这些蛋 1.2.2 早期培养滤液蛋白 IFN-γ-ELISPOT 方法用于结核 白抗原是记忆性免疫 CD4+T 细胞的靶分子[2] 。以早期培养 病的辅助诊断 实验对象为临床确诊的结核病患者（简称患 滤液蛋白为刺激源，结合 γ 干扰素释放技术，可以用于结 者）和无结核接触史且接种过卡介苗（BCG ）的健康志愿者 核杆菌感染的体外诊断。 （简称健康接种者），其中患者 24 例，来源于北京市结核 病控制研究所；健康接种者 20 例，来源于北京市结核病控 1 材料与方法 制研究所和本室工作人员。分别取肝素钠抗凝静脉血 5 ~ 1.1 主要试剂和仪器 10 ml，应用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，单个 H37Rv 分枝杆菌菌种（CMCC93009 ）由本室保存提供； 核细胞经过计数并调整细胞浓度为 2.5 × 106 个/ml 。在已经 超滤离心管（5000 Da ）和 0.22 μm 滤器（500 ml ）均购于 包被 INF-γ 单抗的 96 孔板上，分别加入 50 μl 培养基为 美国 Millipore 公司；结核菌素纯蛋白衍化物（PPD ）（批 阴性对照，50 μl 植物血凝素（PHA ）为阳性对照，50 μl 不 号）由北京祥瑞生物制品有限公司提供；结核感 同浓度（分别为 0.2 、1 和 5 μg/ml ）的早期培养滤液蛋白 染 T 细胞检测试剂盒（T-SPOT.TB，批号 073 ），淋巴细胞 为测试孔。然后在每孔中加入 100 μl 细胞悬液。在 5% 分离液（批号 ）、RPMI1640 无血清培养基（批号 CO2 ，37 ℃ 条件下共同孵育 16 ~ 20 h 。孵育结束后弃去培 8109040 ）和 AIM V 细胞培养液（批号 564772 ）均购自上 养液，用 200 μl PBS 缓冲液重复洗板 4 次。每孔加入 50 μl 海信长医疗器械有限公司；台盼蓝染液（批号 55k2342 ）购