重组蛋白表达与纯化技术服务——原核表达系统(e coli 表达系统).pdfVIP

重組蛋白表達與純化技術服務重組蛋白表達與純化技術服務 ——原核表達系統原核表達系統(E. coli 表表 重組蛋白表達與純化技術服務重組蛋白表達與純化技術服務 原核表達系統原核表達系統 表表 達系統達系統) 達系統達系統 大腸桿菌系統 (Escherichia coli) 說明 大腸桿菌是目前最普遍的蛋白質表現系統，具有生長週期快、產量高及成本低的 優點，但無法進行醣化作用(glycosylation) ，而且形成不溶性的內涵體的機率較 高。內涵體是由於產物表現過快，來不及摺疊，或因缺乏協助摺疊的機制或條件， 以致其在宿主細胞內形成不具活性或活性很低且不易溶解的內涵體，其以顆粒狀 存在於細胞質。形成內涵體時，須先 denaturation ，再進行蛋白質的再折疊，以 期形成正確的三度空間結構，才能恢復其生物活性。 而內涵體的denature 與再折疊的條件需靠實驗測試與經驗找出，產率的高低依不 同蛋白質的特性而有差異。 由於 E.coli的表現系統無法進行醣化作用，而生產醣蛋白，若醣化作用與生物活 性無關，大腸桿菌的蛋白質表現系統是最佳的選擇。而E.coli的表現系統亦可以 做其他的後轉譯修飾。 影響基因重組微生物產率的因子 1.基因序列的優化 (gene optimization) — 密碼子優化，不同的載體與宿主細胞有 著不同的表現系統，最佳化 DNA 序列，可以增加目標蛋白質表現量。 拜爾碁特的全基因合成服務可以協助您快速完成基因序列最佳化! 您可以將欲表現的蛋白質序列及以選定表現的載體與宿主細胞寄給我們 (biokit@.tw) ，我們將協助您完成基因序列最佳化。 2.宿主載體系統 可選用 Novagen的 pET 系統見參考資料( ) 。 不同的載體與宿主系統，對應不同的功能需求，包含啟動子、fusion protein 、 enzyme site 、質體穩定、藍白篩選、協助雙硫鍵的正確結合、適合真核DNA 序 列的表現、毒性蛋白的表現、親和性純化需求與抗藥性需求等。 3.啟動子與誘導方式 大腸桿菌表現系統的啟動子及誘導方法大腸桿菌表現系統的啟動子及誘導方法 大腸桿菌表現系統的啟動子及誘導方法大腸桿菌表現系統的啟動子及誘導方法 啟動子 誘導因子 噬菌體 λP Temperature shift, 30℃or 37℃to 42℃ L lac IPTGor lactose trp IAA or tryptophan depletion tac IPTG or lactose T7 system IPTGor lactose IPTG ：isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside IAA ：β-indoleacrylic acid 所使用的啟動子會影響所表現的蛋白質產物的產率。因為不同的蛋白質有著不同 的特性，需搭配合適的啟動子，而且對大部分的宿主細胞來說，重組蛋白質的製 造會干擾細胞生長，導致重組菌株比生長速率下降，或甚至引起細胞死亡。 4.質體複製數 (copy number) 質體複製數是由質體的遺傳和生長條件所掌控，同時也會受到宿主的遺傳和生理 所影響。重組蛋白質的產生隨複製數增加而增多，故要增加醱酵體積收率的策略 就是應用具有高複製數質體的重組菌株。但往往高複製數菌株，並無法提高體積 產率，可能影響的原因有：生長速率、培養基、溫度、營養匱乏等。 5.質體穩定性 基因重組微生物的醱酵放大重要因子之一為質體的穩定性。質體的不穩定性分為 分離不穩定性(segregational instability) 和結構不穩定性(structural instability) 。所 謂分離不穩定性就是細胞分裂時分離有缺陷，使得菌株失去質體。結構不穩定性 則是因 DNA 的插入、刪除或重新排列改變質體結構，而失去原有基因的功能。 質體穩定與否除了由本身的基因所決定外，亦會受到宿主菌株的基因和生理所影 響。 6.誘導物質濃度 重組蛋白質最佳表現所需的誘導物