脊神经节感觉神经特异蛋白的分离纯化和鉴定＊.pdfVIP

维普资讯 生物物理学报 第十 五卷 第二期 一九九九年六月 ACTA B10PHYSICA SIN ICA Vo1．15 No．2 Jun．1999 脊神经节感觉神经特异蛋 白的分离纯化和鉴定 * 蒲小平 汪家政+ 范明 李长龄 — — — — ～ — — — — 一 北京医科大学药学院 北京 伽 、／ 口 摘 要 为进一事研 究感 觉神妊特 异 蛋 白Z9KB 的站构牵功能 ．我们诅免普神经节疋背根 纤维 曲材 料 ，通过制备匀浆 ，离子 交挟层析 DEAE Sephacel，高压液相凝胶过滤层折分离纯化 了感 觉神控 特异蛋 白29KD．薄层扫描鉴定纯度为 80％以上 ，用蛋 白质 印迹法鉴定了谊蛋 白．井进行 了该蛋 白 的稳定性观 察。为该蛋 白作为鉴 定感 觉神经元噩其 纤维 的标志物 ，和研 究感 觉神蛀元 的再生与功 能 打下 了基 础 关键 词 ： 眷神经感觉蛋 白 纯化 鉴 定 对于周 围神经断裂伤 ，怎样才能准确 、快速 、简便地进行功能束定性吻合 ，在神经外科 中， 如何识别和 区分感觉和运动这两种截然不 同的神经纤维 ，一直是神经科学家及显微外科医生 致力研究但 尚未解决 的难题 。目前还没有一个确切的哺乳类动物感觉神经分子标记物 。例如 神经多肽 CGRP(降钙索基 因相关蛋 白)和 P物质等也 曾作为感觉神经 的标记物 ，但事实上并 不特异地存在于感觉神经 ，顾 晓松等人在 90年代初发现 29KD蛋 白质特异地存在于脊神经 级感觉神经元 ，它呈现特有 的分布规律 ，即分布在后角周缘 、背根 、脊神经节细胞与外周神经皮 支 中，并发现该蛋 白的出现部位与浅感觉纤维 的分布与投射径路一致 。为进一步研究该蛋 白 质 的结构和功能 ，我们用层析 的方法纯化了感觉神经特异蛋 白29KD，并进行 了稳定性观察 。 1 材 料与方法 1．1 材料 新西兰雄性大白兔 ，体重约 2．5kg，由军事医学科学院实验动物 中心供给 ；苯基 甲基磺酸 氟 (PMSF)为 E Merck公司产品，SDS—PAGE低分子量标准蛋 白质为上海东风生化试剂 公司产 品．其余试剂为 国产分析纯 。DEAE—Sephaeel为 Pharmacia公司产 品，uv一120—02 分光 光度计 由Shimadzu生产。HPLC系统及 HPLC柱 TSK G3000sw (75×300ram)为 LKB产 品，RJ一Ⅲ型时速双控电动匀浆器系军事医学科学院仪器厂产 品。UltrascanXL薄层 扫描仪 Phannaeia公司产品 。 1．2 方法 1．2 1 取材和制各匀浆 新西兰大 白兔放血 处死 ，剪 开背部皮肤 ，取全长脊柱 ，在 解剖镜下 ，取脊神经节及背根纤维 作为感觉神经组织材料 ，腹根纤维作为运动神经组织材料 。组织称重 ，在 4℃下加入含有 1 mmoI儿 PMSF、1mmol／LEDTA 20mmol／L磷酸盐缓冲液 (PBpH74)，用 电动匀浆器研 *唇家 自然科学基金瓷助 t39470．56)和留学回国人员启动基盘资助 (1996 644．) **(军事 医学科学 院基础 医学研 究所 ，北京 ，100850) 维普资讯 j16 生 物 物 理 学 报 1999拒 磨 l0分钟 ，分别制备感觉神经和运动神经匀浆 ，冰浴上静置 1小时，以 10000r／rain冷冻高速 离心 lOmin，两种神经 的离心上清液 ．在还原条件下 ，进行 SDS聚丙烯酰胺不连续垂直平板凝 胶 电泳 (SDS PAGE分离胶浓度 l25％)及银染色 ，剩余上清液置冰箱备用 122 DEAE—Sephacel阴