筛选调节hbv增殖和hbsag产生的宿主细胞的 - 第三军医大学学报.docVIP

筛选HBV增殖和HBsAg产生的miRNA 章广玲1，2 王梅梅1朱丽华1，2 熊亚南1 李怡璇2刘民2 汤华2* 袁丽杰1 摘要 目的：筛选调节乙型肝炎病毒（HBV）增殖和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）产生的宿主细胞的miRNA，为研究HBV和miRNA之间的相互作用及作用机制奠定初步的实验依据。方法：用328种miRNA的反义链转染HepG2 2.2.15细胞，72小时收获上清，MTS检测细胞的增殖活性，ELISA检测表面抗原和e抗原的表达水平，实时定量PCR检测其中HBV DNA的拷贝数。构建筛选到的miRNA的过表达载体，转染HepG2 2.2.15细胞，也分别用MTS，ELISA和实时定量PCR进行检测。结果：没有对细胞的增殖活性产生影响的情况下，miR-199a-3p, miR-210和miR-185 抑制了HBV表面抗原的产生和HBV的增殖。结论：miRNA作为病毒与宿主细胞相互作用中的调节因子，在HBV的生命活动周期中具有重要作用。 关键词：miRNA 乙型肝炎病毒 乙型肝炎病毒表面抗原 Screening miRNA with important role in HBV infection ZHANG Guang-ling1,2,,Wang Mei-mei1,Zhu Li-hua1,2 , et al. ABSTRACT( Objective To address which miRNAs influences HBsAg expression, HBeAg expression or the proliferation of HBV in producing HepG2 2.2.15 cells, and to provide vidence for an intricate physiological interplay between the cell’s miRNAs and HBV. Methods Antisense oligonucleotides of special miRNAs were used to reduce the expression of endogenous miRNAs. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and realtime PCR were performed on culture supernatant harvested from HepG2 2.2.15 cells 72 hours after transfection with miRNA ASOs, a CellTiter 96? Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) was used to detect the cell proliferation at the same time. Results　Conclusion　evidence that human miRNAs can inhibit HBV replication, and also reveal an additional layer of an intricate physiological interplay between the cell’s miRNAs and HBV replication. Key words: miRNA; Hepatitis B virus; Hepatitis B surface antigen; 　细胞microRNA的发现不仅影响了生物学方面的研究，而且揭示了一个崭新的转录后基因调节机制[1]。到目前为止，已经确定了几个人类致病性病毒编码的miRNA的潜在功能[2,3]，而人类的miRNA可能对病毒的进化和组织亲嗜性有所影响[4,5]。对miRNA功能的越来越多的了解，为理解病毒感染机制，以及病毒如何建立潜伏感染，逃避宿主天然免疫和适应性免疫，提供了新的视野。在病毒感染过程中，miRNA功能的研究可能也会为治疗病毒诱导的疾病提出新的治疗方法，为此，我们首次研究人类的miRNA, 为研究HBV和miRNA之间的相互作用及作用机制奠定初步的实验依据，为今后开发抗HBV增殖的药物或手段提供新的分子基础或靶位点。脂质体Lipofectamine2000转染试剂和无血清培养基Opti-MEMInvitrogen公司；各种限制性内切酶和T4 DNA 连接酶以及PCR试剂盒均购自日本TaKaRa 公司；Trizol 购自上海生工生物工程技术服务有限公司；小量质粒抽提试剂盒、胶回收纯化试剂盒购自Omega公司；大量提取质粒DNA，用 试剂盒pcDNA3.1(+)由天津医科