基于ly培养基的籼稻成熟胚愈伤组织培养和农杆菌转化说明书.docVIP

基于LY培养基的籼稻组织培养和农杆菌转化说明书 武汉大学植物发育遗传教育部重点实验室 李 阳mail：852 试剂盒内容： LY-培养基（固体）：一瓶，供配制10L 用。 LY-A:500ul （用于诱导，如果有晶体析出，70℃水浴加热溶解即可）。 LY-B:800ul （用于继代，预培养，共培养，筛选）。 LY-C:400ul （用于分化不畅时，用于预分化，如果有晶体析出，70℃水浴加热溶解即可）。 LY-D:2000ul（用于分化，如果有晶体析出，70℃水浴加热溶解即可）。 需要您自己准备的还有：真核抗生素，原核抗生素，乙酰丁香酮 。 蔗糖，酸水解酪蛋白，谷氨酰胺，脯氨酸，如果您的琼脂粉硬度指标不同根据情况自行增减)以及phytagel。 籼稻转基因操作步骤 诱导： 诱导培养基： 1L诱导培养基配制（根据需要等比例缩放）：在1升的烧杯中加入800ml双蒸水，称取3g Phytagel 微波炉加热全部溶化。加入6g LY培养基粉末，800mg酸水解酪蛋白，500mg 谷氨酰胺，500mg 脯氨酸；30g蔗糖加入到phytegel溶液中。加入ly-A:150ul，双蒸水定容到1升。1N氢氧化钾调 pH值：5.8 2， 50ml/瓶分装到100ml容积的三角瓶中，用组培封口膜封口后 115℃灭菌15分钟。冷凝后即可用。 成熟胚诱导 （选用当年新染提高发芽率和诱导率。） 成熟水稻胚去颖壳之后， 75％酒精浸泡1.0min；2，0.15％的HgCl2浸泡10分钟。3，用灭菌水洗4遍，每次1分钟;用灭菌水浸泡5分钟; 再用灭菌水清洗一次。接种到诱导培养基上，每瓶5颗。为保证诱导率接种时最好保持种子发芽方向与培养基平行或者稍微向下，不要让发芽方向向上或者垂直向下。放置28℃,湿度约50%的环境下暗培养，诱导30-40天直到出现明显松散的愈伤组织，进行继代或者进行预培养转化。 继代： 1L继代培养基配制：在1升的烧杯中加入800ml双蒸水，称取3g Phytagel 微波炉加热致全部融化。加入6g LY培养基粉末, 800mg酸水解酪蛋白，500mg 谷氨酰胺,500mg脯氨酸；30g蔗糖, 150ul LY-B加入到准备好的phytagel溶液中,双蒸水定容到1升,1N KOH 调 pH值到5.8 将培养基50ml/瓶分装到100ml容积的三角瓶中，用组培封口膜封口后 115℃灭菌15分钟。 挑取生长旺盛，质地坚硬，色泽嫩黄，颗粒直径3mm左右的愈伤组织进行继代，每100ml三角瓶接种0.3g左右（直径3mm左右的愈伤组织6-7颗）,28℃生长10-15天。 预培养： 1升培养基配制（根据需要等比例缩放）：在一个1L的可灭菌瓶中加入800ml双蒸水，加入6g LY培养基粉末； 800mg酸水解酪蛋白；500mg 谷氨酰胺；20g蔗糖+10g 葡萄糖，500mg 脯氨酸 ；LY-B：150ul；双蒸水定容到1升。调pH值： 5.2， 加入3g phytagel。 115℃灭菌15分钟。冷却到50℃左右加入终浓度100umol的乙酰丁香酮[2]；倒平皿25ml/9cm平皿。超净台开盖晾置30min-60min。 预培养操作： 将生长良好的愈伤组织块接种于预培养培养基上30-40块/9cm平皿，愈伤组织颗粒不易太大3mm左右，28℃暗培养生长3-4天。此时愈伤组织状态应该是色泽黄而且致密。 农杆菌准备：于预培养同一天将转化好的农杆菌菌液在相应抗性的平板上划线， 30度生长36-48小时。再进行一次划线, 生长36-48小时后可以进行转基因操作。 悬浮培养基： 1，每一升悬浮培养基配制方法（根据需要等比例缩放）：在一个1L的可灭菌瓶中加入800ml双蒸水。加入3g LY培养基粉末，； 800mg酸水解酪蛋白；500mg 谷氨酰胺；500mg脯氨酸；20g蔗糖，10g葡萄糖；150ul LY-B；双蒸水定容到1升，pH值：5.2。 2， 110℃灭菌15分钟。灭好菌后4℃可长期放置使用时加入终浓度100uM的乙酰丁香酮[2]。 悬浮侵染操作：将生长好的农杆菌平板上的农杆菌刮到农杆菌悬浮培养基里，28℃震荡,OD值在0.2左右的范围内即可转基因侵染。将预培养的愈伤组织转移到悬浮的菌液中，室温浸泡20-30min。 共培养：同预培养培养基 共培养操作：将菌液到掉，沥干农杆菌菌液，将愈组织伤放置在灭菌后风干的多层（8-10层）滤纸上，尽量浸干农杆菌菌液，超净台晾干20-30min，以免共培养的时候农杆菌生长过多，对愈伤组织损害过度。然后将滤纸上的愈伤组织颗粒挑到共培养培养基上，每皿50颗左右，20-25℃暗培养48-72小时左右。共培养要跟踪观察，如果见农杆菌出现明显，表