实验三蛋白质的沉淀与变性反应.pdfVIP

实验三 蛋白质的沉淀与变性反应 一、实验目的 1．加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识 2．了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义 3．了解蛋白质变性与沉淀的关系。 二、实验原理 多数蛋白质是亲水胶体，在水溶液中，蛋白质分子的表面，由于形成水化层 和双电层而称为稳定的胶体颗粒，所以蛋白质溶液和其他亲水胶体溶液相类似。 但是，蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的、相对的。在一定的物理化学因素影 响下，蛋白质颗粒失去电荷，脱水，甚至变性以固态形式从溶液中析出，这个过 程称为蛋白质的沉淀反应。这种反应可以分为以下两种类型： 1．可逆沉淀反应：在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但它的分子 内部结构并未发生显著变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素出去后，能在溶 于原来的溶剂中。这种作用称为可逆沉淀反应，又叫做不变性沉淀反应。属于这 一类的反应有盐析作用、利用等电点的沉淀以及在低温下，乙醇、丙酮对蛋白质 的短时间作用等。 2．不可逆沉淀反应：在发生沉淀反应时，蛋白质分子内部结构、空间构象 遭到破坏，失去原来的天然性质，这时蛋白质已发生变性。这种变性蛋白质的沉 淀不能再溶于原来溶剂中的作用叫做不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂、 过酸、过碱、加热、震荡、超声波，有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反 应。 三、仪器、试剂和材料 1．仪器 试管及试管架，移液管，玻璃漏斗，滤纸，玻璃棒，烧杯，量筒。 2．试剂 （1）蛋白质溶液：取5ml鸡蛋蛋清，用蒸馏水稀释至100ml，搅拌均匀后 用4~8层纱布过滤，新鲜配制 （2）饱和硫酸铵溶液：称取固体（NH ）SO 加于1000ml蒸馏水中，在70~80 4 2 4 ℃下搅拌促溶，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶 液。 （3）饱和苦味酸溶液：称取2g苦味酸放入三角烧瓶，加蒸馏水100ml，80 ℃水浴约10min 使之完全溶解，于室温下冷却后瓶底析出黄色结晶，上清液即 为饱和苦味酸，此溶液可存放数年 （4）其他试剂：硫酸铵粉末，3%硝酸银，1%醋酸铅，1%硫酸铜，10%三 氯乙酸，0.5%磺基水杨酸，95%乙醇，1%醋酸，5%鞣酸。 四、操作步骤 1．蛋白质的盐析作用 取1支试管，加入3mL蛋白质溶液和3mL饱和硫酸铵溶液，混匀，静置约 10min，球蛋白沉淀析出。过滤后向滤液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻璃棒搅 拌，直至粉末不再溶解，达到饱和为止。析出的沉淀为白蛋白。静置，弃去上部 清液，保留白蛋白溶液，取出部分加水稀释，观察它是否溶解。 2．重金属沉淀蛋白质 取3支试管各加入约1mL蛋白质溶液，分别加入1~2滴3%硝酸银，2~3滴 1%醋酸铅和3~4滴1%硫酸铜，混匀，观察沉淀的生成。 3．有机酸沉淀蛋白质 取2支试管，各加入约0.5mL蛋白质溶液，然后分别滴加10%三氯乙酸和0.5% 磺基水杨酸溶液各数滴，混匀，观察蛋白质的沉淀。 4．有机溶剂沉淀蛋白质 取1支试管，加入1mL蛋白质溶液，再加2mL95%乙醇，混匀，观察沉淀生 成。 5．生物碱试剂沉淀蛋白质 取2支试管，各加2mL蛋白质溶液，及4~5滴1%醋酸，其中1管滴加5% 鞣酸，另一管滴加饱和的苦味酸溶液，观察沉淀的形成。 五、结果处理与分析 对以上所观察的现象进行分析解释并得出结论。 【注意事项】 沉淀反应时应控制好时间。 【思考题】 1. 为什么蛋清可用作铅中毒或汞中毒的解毒剂？ 2. 高浓度硫酸铵对蛋白质溶解度有何影响，说明原因。 3. 蛋白质的可逆沉淀和不可逆沉淀有何区别？有何用途？ 【参考资料】 郭蔼光，郭泽坤．生物化学实验技术．北京：高等教育出版社，2007:62-64．