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实验三蛋白质的沉淀与变性反应

实验三 蛋白质的沉淀与变性反应 一、实验目的 1.加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识 2.了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义 3.了解蛋白质变性与沉淀的关系。 二、实验原理 多数蛋白质是亲水胶体,在水溶液中,蛋白质分子的表面,由于形成水化层 和双电层而称为稳定的胶体颗粒,所以蛋白质溶液和其他亲水胶体溶液相类似。 但是,蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的、相对的。在一定的物理化学因素影 响下,蛋白质颗粒失去电荷,脱水,甚至变性以固态形式从溶液中析出,这个过 程称为蛋白质的沉淀反应。这种反应可以分为以下两种类型: 1.可逆沉淀反应:在发生沉淀反应时,蛋白质虽已沉淀析出,但它的分子 内部结构并未发生显著变化,基本上保持原有的性质,沉淀因素出去后,能在溶 于原来的溶剂中。这种作用称为可逆沉淀反应,又叫做不变性沉淀反应。属于这 一类的反应有盐析作用、利用等电点的沉淀以及在低温下,乙醇、丙酮对蛋白质 的短时间作用等。 2.不可逆沉淀反应:在发生沉淀反应时,蛋白质分子内部结构、空间构象 遭到破坏,失去原来的天然性质,这时蛋白质已发生变性。这种变性蛋白质的沉 淀不能再溶于原来溶剂中的作用叫做不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂、 过酸、过碱、加热、震荡、超声波,有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反 应。 三、仪器、试剂和材料 1.仪器 试管及试管架,移液管,玻璃漏斗,滤纸,玻璃棒,烧杯,量筒。 2.试剂 (1)蛋白质溶液:取5ml鸡蛋蛋清,用蒸馏水稀释至100ml,搅拌均匀后 用4~8层纱布过滤,新鲜配制 (2)饱和硫酸铵溶液:称取固体(NH )SO 加于1000ml蒸馏水中,在70~80 4 2 4 ℃下搅拌促溶,室温中放置过夜,瓶底析出白色结晶,上清液即为饱和硫酸铵溶 液。 (3)饱和苦味酸溶液:称取2g苦味酸放入三角烧瓶,加蒸馏水100ml,80 ℃水浴约10min 使之完全溶解,于室温下冷却后瓶底析出黄色结晶,上清液即 为饱和苦味酸,此溶液可存放数年 (4)其他试剂:硫酸铵粉末,3%硝酸银,1%醋酸铅,1%硫酸铜,10%三 氯乙酸,0.5%磺基水杨酸,95%乙醇,1%醋酸,5%鞣酸。 四、操作步骤 1.蛋白质的盐析作用 取1支试管,加入3mL蛋白质溶液和3mL饱和硫酸铵溶液,混匀,静置约 10min,球蛋白沉淀析出。过滤后向滤液中加入硫酸铵粉末,边加边用玻璃棒搅 拌,直至粉末不再溶解,达到饱和为止。析出的沉淀为白蛋白。静置,弃去上部 清液,保留白蛋白溶液,取出部分加水稀释,观察它是否溶解。 2.重金属沉淀蛋白质 取3支试管各加入约1mL蛋白质溶液,分别加入1~2滴3%硝酸银,2~3滴 1%醋酸铅和3~4滴1%硫酸铜,混匀,观察沉淀的生成。 3.有机酸沉淀蛋白质 取2支试管,各加入约0.5mL蛋白质溶液,然后分别滴加10%三氯乙酸和0.5% 磺基水杨酸溶液各数滴,混匀,观察蛋白质的沉淀。 4.有机溶剂沉淀蛋白质 取1支试管,加入1mL蛋白质溶液,再加2mL95%乙醇,混匀,观察沉淀生 成。 5.生物碱试剂沉淀蛋白质 取2支试管,各加2mL蛋白质溶液,及4~5滴1%醋酸,其中1管滴加5% 鞣酸,另一管滴加饱和的苦味酸溶液,观察沉淀的形成。 五、结果处理与分析 对以上所观察的现象进行分析解释并得出结论。 【注意事项】 沉淀反应时应控制好时间。 【思考题】 1. 为什么蛋清可用作铅中毒或汞中毒的解毒剂? 2. 高浓度硫酸铵对蛋白质溶解度有何影响,说明原因。 3. 蛋白质的可逆沉淀和不可逆沉淀有何区别?有何用途? 【参考资料】 郭蔼光,郭泽坤.生物化学实验技术.北京:高等教育出版社,2007:62-64.

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