竹叶黄酮的分离提取.docxVIP

竹叶黄酮的分离提取、检测与成分分析 姓名：周胤潇 班级:微生物121 学号：201201220414 摘要：竹叶黄酮(Bamboo- leaf-flavonoid, BLF)是我们于上世纪90年代末创制的一种新型植物黄酮制剂,具有优良的抗自由基、抗氧化、抗疲劳、耐缺氧、抗病毒、抗菌、抗炎、降脂、扩冠和免疫增强活性等（1-2）。竹叶总黄酮以其巨大的资源优势和良好的药理活性将成为一种非常有前途的天然药物,具有广阔的开发前景.本实验主要对竹叶中黄酮类物质的含量用紫外分光法进行测定以及高效液相色谱法对竹叶提取物的成分分析。 关键词：竹叶 黄酮类物质 紫外分光法 高效液相色谱法 前言 竹子为禾本科Poaceae竹亚科Bambusoideae多年生常绿植物，在我国分布很广，资源十分丰富。竹子在建筑、水利、农业等领域都有广泛的应用，然而，竹子加工利用后，竹叶却总是被弃置，造成了极大浪费。近年来的研究发现竹叶中含有多种活性物质，其主要活性物质是黄酮类物质,含量平均在2%,竹叶提取物中的有效成分主要是以荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷为代表的碳苷黄酮和以对香豆酸、绿原酸、咖啡酸和阿魏酸为代表的植物酚酸为主，竹叶黄酮中的功能因子主要是黄酮糖苷和香豆素内酯,黄酮类物质是一类天然植物成分，具有显著的生理及药理活性，黄酮类成分有明显的抗溃疡、解痉、抗菌、抗炎、降血脂、镇痛和雌性激素等生物活性和生理活性作用⑶。 实验目的： （1）掌握样品的前处理的方法 （2）掌握竹叶黄酮的提取、分离与纯化 （3）用 硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定竹叶子中总黄酮 （4）采用超高效液相色谱（UPLC）定量分析竹叶中荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡 荆苷、对香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸 8 个特征性成分的量。 1 实验材料和仪器 1.1实验材料： 竹叶（摘自浙江农林大学校园内） 标准样品：甲醇（分析纯）、乙醇（分析纯）、亚硝酸钠、硝酸铝、石油醚（分析纯）、氢氧化钠、芦丁标准品（购自中国药品生物制品检定所，纯度均大于98%）、去离子水。 芦丁标准溶液：精确称取经105℃干燥至恒重的芦丁对照品5.600mg，加入甲醇溶液定容至50mL，配成112ug/mL的芦丁标准溶液。 5%亚硝酸钠溶液：称取约5.263g亚硝酸钠溶解在100mL去离子水，置于4℃冰箱中备用。 10%硝酸铝溶液：称取约11.111g硝酸铝溶于100mL去离子水中，置于4℃冰箱中备用 1.0mol/L氢氧化钠溶液：称取4.000g氢氧化钠溶于100mL去离子水中，置于4℃冰箱备用。 1.2实验仪器： 40目筛 高速冷冻离心机、 旋转蒸发仪、 紫外分光光度计、 微波炉、 粉碎机、 回流装置 密封袋 ACQUITY? Ultra Performance LC超高效液相色谱系统，包含二元溶剂管理器，样品管理器，柱温箱和二阵管阵列检测器； Micromass Q-Tof micro TM 串联质谱（美国Waters公司） 2 实验原理及方法 2.1 实验原理： 浸提、洗脱原理： 根据相似相溶原理，对所用溶剂按黄酮类化合物的极性来选择，竹叶中所含的有效活性物质主要为黄酮甙类，具有较大的极性和亲水性，故可以选择热水、甲醇、乙醇、丙酮等溶剂进行浸提。但由于水的极性过大，且易于将蛋白质、糖类的易溶于水的成分浸提出来，且水提法提取物存放易发霉，从而影响黄酮类化合物的提取和分离。故本实验选用甲醇水溶液作为浸提及洗脱溶剂⑷。 2.2工艺流程（5，6，7） 新鲜竹叶→洗净烘干→ 破碎 →过筛（40目）→ 回流浸提 →抽滤→悬蒸→定容→测定吸光度→ 分析计算 2.3实验步骤 2.3.1 竹叶处理 采集竹叶，，立刻用微波炉进行杀青干燥（微波炉，700W，间隙加热2~3次，每次60S），将烘干的竹样用粉碎机粉碎，过40目筛，将滤过的竹样粉末放入密封袋中密封，放置于-40℃冰箱中储存备用。 2.3.2 竹叶黄酮的提取与纯化 2.3.2.1 竹叶黄酮的提取 1.精确称取竹样粉末各200.00g。 2.加入150mL60%乙醇-水溶液，浸泡30min。 3.水浴锅水温75℃热回流提取1h。 4.冷却至室温，过滤，收集滤液。 5.在滤渣中加入50mL60%乙醇进行二次回流30min。 6.冷却至室温收集滤液，弃滤渣，密封，标号，置于4℃冰箱，备用。 2..3.2.2萃取、纯化 在竹样粗提取液中加入100mL石油醚进行萃取脱脂脱叶绿素，弃上清液取下沉液，再次加入100mL石油醚进行萃取，重复2次，将提取液密封保存至4℃冰箱备用。 2.3 .2.3 浓缩干燥 将萃取过的竹叶提取液用旋转蒸发仪将其浓缩干燥，将干燥后的残渣（黄酮初提物）用60%甲醇定容至100mL容量瓶