血管生长抑制因子Angiostatin在昆虫细胞中的高效表达及其活性分析.pdfVIP

中文摘要 r箭，一～言沁，皿·一一‘r前 言沁，弘。一7‘ 、、…一／， 血管形成(angiogenesis)是指在现存的血管中长出新的毛 细血管网的过程。／微毛细血管网主要是由内皮细胞组成，在其形 成的复杂过程中存在多种控制因素，能在短时间内打开或关闭其 形成。其形成依赖于血管生成刺激因子和抑制因子之间的净平 衡，即刺激因子的上调作用和抑制因子的下调作用。血管形成是 实体瘤生长和转移的必需条件之一。肿瘤生长到一定程度时，其 进一步生长有赖于血管为其提供氧气和营养成分，因此，抑制新 生血管的形成，有助于抑制肿瘤曲生长，减少和预防转移的发 生，是肿瘤治疗的新策略。，堆血管生成抑制因子的家族中血管抑 素(angiostatin)作为内皮细胞特异性的抑制剂已显示出强大的 作用。／血管抑素angiostafin是纤溶酶原的内源片段，包括四个 kringle结构，是一种重要的内源性新生血管生成抑制剂。它能通 过直接抑制血管内皮细胞扩增起作用，在肿瘤血管形成的负调控 方面起着重要作用。然而，angiostatin对内皮细胞的作用机制并 不十分清楚，其结构和功能的研究往往受无法获徒星够量的，可 溶的，能正确折叠的，有活性的蛋白的限制。／)-为克服这些目粉 获得具有高活性的angiostatin表达，为进一步研究及应用奠定物 质基础，我们通过杆状病毒表达系统表达重组的angiostatin，本 研究就是在昆虫细胞中表达和分析angiostafin，并研究其生物活 性。 ／实验方法 1．构建重组病毒：用已经构建好的angiostafin杆状病毒转 实验筛选出纯的重组斑点并扩增产生P一1病毒贮存液。之后利 P一1病毒贮存液扩增产生大量高滴度的P一3病毒贮存液，准备 进行重组蛋白的表达。 合性angiostatin基因的高滴度重组杆状病毒贮存液感染草地贪夜 蛾Sf9细胞，用SDS—PAGE电泳和Westernblot对感染不同时间 后分泌的重组蛋白做时间表达分析，依此确定最适的感染复数 (MOI)和感染时间，以达到重组蛋白表达水平最适化，而后大 规模进行重组蛋白的表达，SDS—PAGE用来分析重组蛋白， Western Blot用来在蛋白表达水平低的情况下检测表达的特异重 组蛋白。 化系统对其进行纯化后，分光光度计确定蛋白含量，SDS— PAGE电泳确定蛋白纯度。 4．验证重组蛋白ang／ostafin的生物活性：采用IVIT／法测定 重组蛋白对原代培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的抑制作 用，绘出抑制曲线，并计算出IC，。。而后通过鸡胚尿囊膜实验进 一步证实其抗血管形成作用。 实验结果 ·2· 杆状病毒，并在昆虫细胞sf9中高效表达了分子量为53KD的an— 皮细胞的生长，lC卯为2．3¨g／rnl，而且显著抑制鸡胚尿囊膜血 管的生长。 讨 论 血管生成对于肿瘤生长来说是一个必需的过程，受内皮细胞 增殖刺激因子和抑制因子的共同调控。通过抑制肿瘤血管生成达 到抗肿瘤目的已成为肿瘤治疗的新策略。Angiostatin已被证实是 一种很具潜力的抗肿瘤生长和转移的因子，因而若获得大量具有 高活性、高纯度的angiostafin对肿瘤的治疗会有重要的意义。原 核表达的angiostatin蛋白以包涵体形式存在，在变性、复性过程 中不稳定，易形成多聚体而失活，因而影响了表达产物的临床应 用。杆状病毒表达系统是一种应用很广泛的表达外源基因的真核 表达系统。利用杆状病毒表达系统可以在昆虫细胞中高效表达原 核和真核蛋白，表达的重组蛋白能正确地进行翻译后加工，比如 糖基化和磷酸化。因此我们用杆状病毒表达系统高效表达了该因 子的重组蛋白，这样可对其进行正确的折叠，例如二硫键的形成 和其它翻译后的加工，使其接近天然蛋白，并具有较好的生物活 性。获得这样的蛋白是对其生物活性及作用机制进行研究的前 提，并为其进一步在肿瘤治疗方面的应用奠定了良好的物质基 础。j，∥。7 ／ 结 论? 1．本研究是国内首次应用杆状病毒