循环酶法同型半胱氨酸检测关键酶cbs和cbl 的开发及试剂盒研制初探.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１７，３７（２）：８１８７ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 循环酶法同型半胱氨酸检测关键酶ＣＢＳ和 ＣＢＬ 的开发及试剂盒研制初探 １２ １ １ １ １ １ ２ １ 王笃强 　沈云龙 　廖远平 　李德彬 　刘虹均 　陈　帅 　卢大儒 　朱化星 （１吴江近岸蛋白质科技有限公司研发部　苏州　２１５２２２） （２复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室　上海　２００４３３） 摘要　以酿酒酵母基因组为模板通过 ＰＣＲ分别扩增胱硫醚 合成酶（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ， β β ＣＢＳ）和胱硫醚 裂解酶（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ ｌｙａｓｅ，ＣＢＬ）目的基因片段，经无缝克隆构建表达质粒并 β β 转化大肠杆菌菌株Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）。经诱导表达和纯化后，重组蛋白的纯度均达到９０％，回 收率均达到８０％，可溶表达量分别为２６ｍｇ／Ｌ和３３２ｍｇ／Ｌ。经催化活性测定，ＣＢＳ的单位酶活为 １５Ｕ／ｍｇ，ＣＢＬ的单位酶活为 ７２Ｕ／ｍｇ。在此基础上初步开发了循环酶法同型半胱氨酸 （ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ，Ｈｃｙ）检测试剂盒，实验结果证明该试剂盒的有效性和稳定性均符合体外诊断检测 的要求，其检测性能与市售进口同类试剂盒基本一致。 关键词　胱硫醚 合成酶　胱硫醚 裂解酶　同型半胱氨酸　酶活测定 β β 中图分类号　Ｑ８１９ ［８］ 　　近些年的研究表明，同型半胱氨酸（ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ， 成丙酮酸、Ｈｃｙ和氨 ，Ｈｃｙ可再循环进入第一步反应， Ｈｃｙ）代谢水平高低与心脑血管疾病、糖尿病等疾病存 增强整个级联反应的信号，随后 ＬＤＨ催化丙酮酸与 ［１３］ ＋ 在紧密联系 ，因此建立快速高效的Ｈｃｙ检测方法， ＮＡＤＨ反应生成乳酸和ＮＡＤ ，因此可以通过直接测量 ［４］ ＮＡＤＨ在３４０ｎｍ波长下吸光值的变化反映检测体系中 对基础研究乃至临床医学均具有至关重要的作用 。 ［１１］ 　　目前，同型半胱氨酸的检测主要包括同位素法、色 游离Ｈｃｙ的浓度 。 谱法、免疫法与荧光偏振技术结合等方法，存在操作繁 　　综上所述，开发三酶循环法 Ｈｃｙ检测试剂盒的关 琐、仪器昂贵、实验成本较高等弊端，无法全面普 键是获得具有催化活性的ＣＢＳ和ＣＢＬ重组蛋白。本研 ［５７］ ［８］ 究成功地从酿酒酵母基因组中扩增获得 ＣＢＳ和 ＣＢＬ 及 。而循环酶法具有快速、简便、灵敏度高 ，易于 自动化等特点，该方法根据实验原理的不同，具体分为 目的基因，经无缝克隆构建表达质粒并转化大肠杆菌 腺苷同型半胱氨酸循环酶法（四酶法）和胱硫醚循环酶 ＢＬ２１（ＤＥ３）进行重组表达。经亲和层析纯化后获得高 法（三酶法）两种类型。相对于四酶法，三酶法所需酶 纯度和高活性的ＣＢＳ和ＣＢＬ重组蛋白，并根据三酶法 种类更少且反应中间条件更易控制。 工作原理进行了Ｈｃｙ检测试剂盒的初步开发和性能验 　　本研