剖析第二章核酸的结构.pptVIP

2 核苷的解离 核苷中的糖对碱基解离有一定的影响，核糖上的羟基也可发生解离。 3 核苷酸的解离 含有磷酸，使核苷酸具有较强的酸性。磷酸可发生两级解离，分别称为第一磷酸基团解离（pKIP)和第二磷酸基团解离（pKIIP) * 4 核酸分子的解离 核酸分子多核苷酸链中，除末端磷酸残基外，磷酸二酯键中的磷酸残基只有一个解离常数（ pKa=1.5)，因分子中磷酸残基pKa较低，当溶液pH值高于4时，核酸分子几乎全部解离呈多阴离子状态，故可把核酸看成具有较强酸性的多元酸。可与金属离子成盐，也可与碱性蛋白结合。 碱基解离与pH有关，碱基解离又影响碱基对之间氢键性质，因此pH影响双螺旋碱基对间氢键稳定性。DNA在pH4.0～11.0之间稳定。 5 核苷酸与核酸的等电点 核酸和核苷酸既有酸性磷酸基,又有碱性基团,所以是两性电解质，在一定的pH条件下，可以解离而带电荷，因此都有一定的等电点， RNA等电点为pH2.0～2.5，DNA等电点为pH4.0～4.5 * 四、核酸的颜色反应 由于核酸的磷酸基酸性较强，常表现为酸性，能与Na＋、K＋、Mg＋等金属离子结合成盐，也易与碱性化合物结合成复合物，如与甲苯胺蓝、派罗红、甲基绿等碱性染料结合。其中甲苯胺蓝能使DNA、RNA都染上蓝色，派罗红专染RNA成红色，甲基绿专染DNA成绿色，故细胞组织化学中利用此性质用于核酸染色。 1 地衣酚反应 D-核糖与浓盐酸和苔黑酚(甲基间苯二酚)共热产生绿色，在670 nm有最大吸收。 * 2 二苯胺反应 D-2－脱氧核糖核酸和二苯胺一同加热产生蓝紫色，在595 nm有最大吸收。可利用这两种糖的特殊颜色反应区别DNA和RNA或做为二者定量测定的基础。 3 钼蓝反应 用强酸将核酸样品高温消化，使有机磷变为无机磷，进一步与钼酸铵反应生成磷钼酸，经还原生成蓝色复合物，650nm测定 * * 五、 核酸的变性和复性 (一) 核酸的变性 天然的双螺旋DNA和具有双螺旋区的RNA溶液在一些物理化学因素的作用下，氢键断裂，空间结构破坏，双螺旋解开，变成无规线团状态的现象称为DNA变性。DNA变性后会发生性质改变，如生物学功能部分或全部丧失，紫外吸收增强（图）、粘度下降，浮力密度升高等。变性主要是二级结构的改变引起的，并不涉及磷酸二酯键断裂。引起核酸变性的理化因素有：加热、有机溶剂、酸、碱等。核酸变性后由于原双链中向内互补的碱基对拆离暴露，故对260 nm紫外吸收值增高，该现象称为增色效应。反之为减色效应。 DNA的加热变性从开始解链到完全解链，是在一个相当窄的温度范围内完成的，因此加热DNA溶液达一定温度时，260nm的吸光度骤然增加，最后达到最大值，其过程类似与晶体的熔解，以温度对其紫外吸收值作图得一曲线，将紫外吸收的增加值达最大增加值一半时的温度值称熔解温度(Tm)(图)，即50%DNA变性时温度。 * 图 DNA的熔点 * 影响变性温度的因素有：①三个氢键的G-C对与二个氢键的A-T对相对含量，DNA链中G-C对含量愈高,亦愈高反之则低。有经验公式为:. ②溶液的离子强度可影响，离子强度高，升高，因为DNA链上解离带负电荷的磷酸基团与介质中正离子形成离子键，稳定双螺旋结构。离子强度较低的介质,较低。在纯水中，DNA在室温下即可变性。DNA制品不应保存在极稀的电解质液中。RNA也具有螺旋→线团之间的转变。但由于RNA只有局部的双螺旋区，所以这种转变不如DNA那样明显。变性曲线也不那么陡，值较低。③溶液的pH，高pH下碱基广泛失去质子，氢键形成的能力丧失。pH大于11.3时,DNA完全变性。pH低于5.0时，DNA易脱嘌呤。对单甲酰胺、尿素、甲醛等可破坏氢键,妨碍碱基堆积,使下降,常使用作变性剂. * (二) 核酸的复性 在适当条件下，变性DNA分开的两条互补链可重新经由氢键连接而形成双螺旋结构的过程叫复性(renaturation)。复性后DNA的一系列理化性质得到恢复，如粘度增高，生物活性部分恢复，260 nm紫外吸收降低到原来变性前的水平。变性核酸复性时需缓慢冷却，故又称退火。 复性时核酸单链随机碰撞，不能形成碱基配对或只形成局部碱基配对时，在较高的温度下两链重新又分离,经多次试探性碰撞，碱基配对正确，才能形成完整的双螺旋（图）。如果复性过快，单链上碱基来不及识别配对，则仍为单链。核酸复性时，温度不宜过低。一般认为比Tm低25℃左右的温度是复性的最佳条件 。 * 图 核酸的变性与复性过程 * (三) 核酸杂交 在退火条件下，不同来源的DNA由于某区域碱基互补，成双链，或DNA单链和RNA链的区域性碱基互补形成DNA-RNA双链杂合的过程称核酸杂交，或分子杂交。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基序列完全互补，只要有一定同源序列（不