曹勤红《基础生物化学》第十六章 重组DNA技术.pdfVIP

第十六章 重组DNA技术 • 重组DNA技术就是利用人工手段将目标DNA 与特定的载体DNA连接，形成重组DNA分子， 并将其转入受体细胞中。随着受体细胞的 生长、分裂和分化，使目标DNA得到扩增或 表达，从而改变受体细胞性状或获得目标 基因表达产物的一种技术。 基因工程简介 ◆目的基因的获取； ◆基因载体与目的基因的重组； ◆受体细胞的选择（DNA克隆） 一. 重组DNA技术主要的工具酶 （一）限制性内切酶 粘性末端 平末端 （二）DNA聚合酶 1，Taq DNA聚合酶 2，Pfu DNA聚合酶 （三）逆转录酶 （四）DNA连接酶 逆转录PCR 逆转录酶 二、获得目的基因 （一）聚合酶链式反应（PCR）法 （二）基因组文库法和cDNA文库法 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR) • 是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 • 它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重 复性好、易自动化等突出优点； • 能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一 DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使 肉眼能直接观察和判断； • 可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增 出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。 PCR基本原理 ①模板DNA的变性： ②模板DNA与引物的退火(复性)： ③引物的延伸： 重复循环变性－退火－延伸三过程，就可获得 更多的“半保留复制链”。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增 放大几百万倍。 ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94 ℃左右一定时 间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解 离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应 作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成 单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的 互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶 的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱 基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 重复循环变性－退火－延伸三过程，就可获得更多的 “半保留复制链”。 PCR原理 PCR反应五要素 • 引物 • 酶 • dNTP • 模板 • Mg2+ PCR反应步骤举例 • 94 ℃，5min • 94 ℃, 15sec • 60 ℃,30sec 35cycles • 68 ℃,3min • 68 ℃,5min • 4 ℃,∞ 三. 基因载体 •噬菌体 •质粒 •粘粒 •人工染色体 四、目的基因与载体的连接 （一）黏性末端连接 （二）平端连接 五、转化与筛选 转化： • 细菌：氯化钙；电穿孔; • 细胞：磷酸钙；脂质体；电穿孔；微注射； • 动物：微注射；电穿孔；精子； 受 体 细 胞 筛选 • 根据载体上的抗药性标记插入失活进行筛 选 • 根据载体上的抗药性标记进行筛选 • 蓝白斑筛选 蓝白斑筛选 • 质粒载体上具有β-半乳糖苷酶基因的调控序列和 β-半乳糖苷酶前146个氨基酸的编码信息 • 编码区插入了多克隆位点，但不破坏原来的阅读 框 • 宿主细