第3章 电磁生物物理3 生物组织的电特性测量.ppt

* * 3.3 Measurement of electrical characteristics of biological tissue生物组织电特性的测量 1. Microelectrode technique 微电极技术 2. Voltage clamp technique 电压钳技术 3. Patch clamp technique 膜片钳技术 1. microelectrode technique微电极技术 凌宁和Gerard,1949年，在美国发明了拉制玻璃微电极技术 目的：测量细胞跨膜电位 材料： 含硅量高的Pyrex或国产GG-17玻璃拉制 内灌2~3mol/L KCl溶液，微电极尖部直径约0.5微米。 困难1：微管中KCl溶液灌不进去。 原因：玻璃毛细管弯曲液面附加压强大及其他流体力学因素 克服办法：在微管中置入0.1mm的玻璃细丝，拉制微电极时，此丝伴同一起延伸且附于管壁上，在玻璃丝与管壁间形成狭角沟槽进行自动灌充——毛细现象 困难2：溶液中分布电容，且随浸没深度而增加，将使输入信号发生高频畸变 克服办法：是在尖部外壁涂少量脂类，以减小分布电容； 困难3：AgCl丝作为参考电极会产生电位，且与电极尖部直径也有关，越细电位越大。 克服办法：采用性质相同的微电极作为参考电极 微电极电位与微电极尖部直径有关，尖部愈细电位愈大。 2. Voltage clamp technique电压钳技术 难题：在动作电位中有一很大的电容电流，它与膜电位的变化速率成正比，覆盖和淹没了离子电流，因而很难直接测量离子电流。 Hodgkin和Huxley首创电压钳技术。 电压钳技术：控制跨膜电位在某一固定水平。 基本思想：用负反馈的电子线路将膜电位固定在希望的标定值上，同时测量膜电流的变化。再以电压与电流之比求出膜电导的变化，用离子通道电导特性的变化描述生物膜电导的变化。 电路：电阻+电容；串联+并联 膜等效电路 膜电流 电容电流 离子电流 只要固定膜电位不变，使膜电容电流为零，则膜总电流等于离子电流——电压钳技术原理 空间钳位 具有空间间隙 吸附电极 小细胞 双微电极 大细胞 测量单一离子的电流 用胆碱离子置换细胞外液中的Na+ =排除INa 得到“纯净”的K+电流IK 将总电流减去K+电流 =得到纯Na+电流，即INa=Im-IK 目前主要采用神经药理学的方法分离离子流 已经发现： 河豚毒素TTX能特异性地阻断Na+离子流 四乙基胺TEA能阻断K+离子流 CdCl2能阻断Ca2+离子流 3. Patch clamp technique膜片钳技术 Neher和Sakman，1991年获诺贝尔生理与医学奖 目的：从分子水平了解生物膜离子单通道开关、动力学，通透性和选择性等膜的信息。 膜片钳技术：用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个μm2的细胞膜通过负压吸引封接，使电极尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端笼罩下的膜与膜的其他部分从电学上隔离，因此，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个极为敏感的电流监视器(膜片钳放大器)测量此电流强度——单一离子通道电流。 特点：脱离细胞，单独研究一部分细胞膜 施加电压 前提：电压钳技术 优点： 直接测量生物膜的单通道电流 比较容易对小细胞（10μm）作电压钳位 可以任意改变膜内外溶液的成分和浓度，研究各种药物和化学物质对离子通道的影响 由于膜片钳技术空间分辨力高，在中枢神经研究中可分离胞体与轴突和树突的离子电流 操作方式——细胞贴附式 细胞贴附在吸管顶端，形成高阻封接，使吸管末端的膜片在电学上与细胞其他部位隔离。 微吸管必须进行热抛光和清洁处理，细胞必须经过酶清洁处理，除去结缔组织，粘附细胞及基膜。 此时对电极内加轻度负压使电极尖端与膜之间形成紧密接触 膜呈微凸形，可高分辨的测量膜电流或通道电流。 操作方式——全细胞记录式 用灌注无钙KCl溶液的微吸管吸附细胞形成高阻封接 直接向微吸管内加电脉冲或短暂的高负压 吸附吸管末端内的细胞膜破裂 电极和胞内溶液直接相通 电流或扩散物进入细胞内 Whole Cell On-Cell 操作方式——外面向外式 在全细胞记录方式下提起吸管，就形成外面向外的膜片 Whole Cell outside-out patch 操作方式——内面向外式 高阻封接 将微吸管提起 膜被拉出，在吸管末端形成一小泡 在空气中暴露几秒钟，小泡破裂 将吸管放入预先制备好的溶液中 膜片内侧与溶液接触便形成内面向外的膜片