人工转录激活因子激活小鼠内源Oct4基因的研究.docVIP

　　人工转录激活因子激活小鼠内源Oct4基因的研究 第一章 文献综述 1.1转基因与基因靶向修饰 基因组靶向修饰是研究生物分子遗传与进化中的一种新方法，特别是在基因治疗与进化发育研究，基因组靶向修饰技术拥有巨大潜力。通过转基因技术，人们按照意愿，改变生物的遗传密码，获得转基因生物模型。传统的基因修饰是对基因序列进行突变或少量的碱基的插入与缺失，改变原有基因型或者阅读框，是基因不能正常的编码蛋白序列。而现代的基因修饰不仅仅是基因序列进行突变或少量的碱基的插入与缺失，还包括了基因敲除（Gene knock-out）、基因敲入（Gene knock-in）、基因修复（Gene editing）。还有不改变基因的序列，但对基因表达进行调控：基因甲基化或去甲基化、基因激活、基因抑制等。自从 1981 年，世界上第一只转基因小鼠的成功培育（Palmiter R D et al. 1982），人们开始尝试利用各种途径来对物种的基因组进行修饰、修改，期望改变物种基因的表达，探索基因的功能。在随后的二十多年间，基因组靶向修饰的发展速度极其缓慢。逆转录病毒（Jaenisch R 1983）以及同源重组（Capecchi M R.1989）是这段时间最常用的方法。但是这些传统的方法存在很多的缺陷：逆转录病毒可以整合入物种的基因组中，存在一定的安全隐患，且逆转录病毒的整合位点是随机的，难以检测其整合位点，如果整合入某些看家基因中，可能会影响看家基因的表达，造成基因缺陷病；同源重组法通过长片段的同源臂与基因组进行定点基因重组，但细胞中同源重组的效率很低，一般重组概率为 10-6～10-7。由于这些传统方法的局限性，转基因只有部分模式生物如酵母、小鼠、果蝇中实现。转基因技术的发展亟需一种可以靶向修饰基因组的工具。近年，人工靶向核酸酶（Engineering targetable nucleases）的出现让转基因物种的生产进入了一个黄金时代（Segal D J and Meckler J F 2013）。人工靶向核酸酶一般由 DNA结合域和 DNA 切割域组成。DNA 结合域能识别特异的 DNA 序列，并结合在 DNA 上；DNA 切割域可以在靶位点处切割 DNA 双链，造成 DNA 双链断裂（Double-strand Break,DSB）或 DNA 单链切口（Nicking）。DNA 的损伤会激活细胞内的修复机制：非同源末端连接（Non-homologous end joining，NHEJ）或同源重组（Homologous rebination，HR）。非同源末端连接修复一般会在 DNA 双链断裂处造成少数核苷酸的插入或缺失（Indel），造成基因突变，大多数情况会造成阅读框的改变而使得基因功能丧失。当存在同源臂的情况下，DNA 双链断裂还能通过同源重组修复：在 DNA 双链断裂处通过同源重组直接修复 DNA 或者在 DNA 双链断裂处引入新的基因。人工靶向核酸酶不仅能提高基因突变的概率，也能大幅增加基因重组的效率（Rouet P et al. 1994）。 1.2类转录激活效应因子（TALE） 类转录激活效应因子（Transcription activator-like effectors，TALE）是在植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas spp.)中发现的一种跨物种的转录激活因子。黄单胞菌能侵染水稻、甘蓝、柑橘等多数农作物，TALE 在侵染过程中起着关键作用。第一个 TALE 是AvrBs3，首次在辣椒病原菌 Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria 中发现，可以诱导 20个辣椒基因的转录。AvrBs3 无任何毒性，但能引起含有抗病基因 Bs3 辣椒的免疫反应。随后，又在其它黄单胞菌的中发现了超过 50 个类似 AvrBs3 的基因，将它们都归为 AvrBs3家族，它们有的无毒性，有的可以使病原菌侵染植物引起疾病。研究发现，AvrBs3 家族的蛋白高度同源，AvrBs3 家族在 N 端存在一个Ⅲ型分泌信号，随后是一段高度重复的DNA 结合序列，接着是核定位信号（NLS），最后是一个酸性的转录激活域。AvrBs3 家族的蛋白能结合在宿主基因组上，调控宿主基因的表达，因此将它命名为类转录激活效应因子。2004 年，研究人员发现，植物的某些基因发生突变，TALE 无法再与 DNA 结合，从而获得对黄单胞菌的抵抗能力。人们开始注意到 TALE 独特结构及其与 DNA 之间的相互作用。 . 第二章 人工 TALE 转录激活因子的快速构建及激活 MEF 内源Oct4 基因 2.1 TALE 四聚体库的构建 传统的 TALE 组装方法需要大量不同的引物，在扩增过程中可能引入突变；并且连接过程中，可能会因为 IIs