人白血病、骨肉瘤细胞抗甲氨蝶呤细胞系构建及抗药性鉴定.docVIP

　　人白血病、骨肉瘤细胞抗甲氨蝶呤细胞系构建及抗药性鉴定 第 1 章 前 言 1.1骨肉瘤 骨肉瘤俗称成骨肉瘤（Osteosara）是非常常见的恶性肿瘤之一，病发几率仅次于软骨肉瘤，占骨生肉瘤的比例为 60%，且恶性的程度很高。目前为止大多数的研究人员认为骨组织的任何部分都能产生骨肉瘤，其中骨膜的深层是最容易发生病变的，但至今为止发病原因未能明确。近些年来通过大量的实验研究发现骨肉瘤的发病根据不同性别人与内分泌发育的时间以及早晚有直接关系，此病发病多为青少年，年龄大多在于 14-24 岁之间。对于这些人群中多数患者在诊断出骨肉瘤的同时已经在肺部有所转移，对于单纯病发截肢的患者术后 3-5 年的生存率不到 20%[1]。骨肉瘤的症状表现为肿瘤部位的肿大并伴随着不同程度的疼痛并且这是非常常见和明显的症状，其疼痛的时间一般在晚上比较重。肿瘤部位由于膨胀的肿瘤组织破坏了骨皮质而导致刺激骨膜神经末梢。早期症状为周身状况较差，具体表现为发热、不适、体重下降、贫血以至衰竭疼痛感。由早期的间歇性发展成中后期的持续性，疼痛的程度也有所增强。随着病情不断恶化，局部将会出现肿胀，肿块周围经按压将出现疼痛感。随着肿块迅速增长，直观上可发现肿块也能观察到浅表静脉血管，肿块大小及硬度的不同可以看出骨化程度的不同。肿块不断的增大，造成关节活动受限和肌肉的萎缩，患者常常出现避痛性跛行。从病理学方面研究骨肉瘤，肿瘤性成骨细胞是其主要成分、肿瘤性骨样组织和肿瘤骨的多少是根据成骨细胞数决定的。当细胞分化数目相对较多时，肿瘤骨多即硬化性骨肉瘤，当细胞分化数目相对较少时，肿瘤骨较少即溶骨性骨肉瘤。骨肉瘤介于二者之间，即有不同程度的硬化性和溶骨性。 1.2MTX 和骨肉瘤 对于骨肉瘤的治疗的化疗药物通常都是以甲氨蝶呤、阿霉素、异环磷酰胺为主，其中高效的甲氨蝶呤有效致病率约为 50%，停药后不会影响其它化疗药物的使用；阿霉素对于治疗骨肉瘤的效果在 40%-65%，但是在治疗过程中对于心脏的伤害特别大，临床上的治疗方案也很少；异环磷酰胺被认为抗骨肉瘤的关键性药物，但再配合其它药物会存在一定的毒性，临床上还在进一步观察中[10]。综上所述，我们知道甲氨蝶呤（MTX）是现在很多化疗药中相对来说有效的治疗方法并通过 FDA 的认证。氨甲蝶呤（methotrexate，MTX）即对-[（2，4- 二氨基-6 蝶啶）N- 甲基甲氨酸] 苯甲基甲胺酸，在临床治疗时以消旋体形式应用，促进细胞凋亡。MTX 的血浆浓度水平对于不同病人有所差异，即使是对同一个病人，在不同疗程也不一样。这与很多因素有关，例如：年龄、肾脏对 MTX 的排泄能力、机体对 MTX 浓度高低、给药时间等等，通过对 MTX 血浆浓度水平的研究，若干组数据表明 MTX 的血浆浓度同肿瘤反应率及生存率呈显著的正性关系。MTX 适用于很多种疾病，如：1、各类型急性白血病，特别对于急性淋巴细胞白血病；恶性淋巴瘤，非何杰金淋巴瘤和蕈样肉芽肿，多发性骨髓病； 2 、恶性葡萄胎、绒毛膜上皮癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、睾丸癌； 3 、头颈部癌、支气管肺癌、各种软组织肉瘤； 4 、高剂量用于骨肉病，鞘内注射可用于预防和治疗脑膜白血病以及恶性淋巴瘤的神经侵犯。 第 2 章 材料与方法 2.1 仪器仪器 名称 型号 厂家 恒温金属浴 MK200-2 雷伯尔（北京） 转移脱色摇床 T5-8 雷伯尔（北京） 水浴锅 DK-S24 荣华仪器制造有限公司 灭菌器 MLS-3750 安泰公司苏净集团 电热恒温干燥箱 DHLST-9140A 安泰公司 苏净集团海尔低温保存箱 Dicro17 Thermo 混匀器 HYQ-3110 鼎国 制冰机 SIM-F140AY65 日本三洋公司 电热恒温培养箱 DNP-9082 苏州安泰公司 电子天平 LD2102 日本岛津公司 超声破碎细胞粉碎机 JY92-IIN Biotek 电泳仪 JY300C Biored 净水设备 FFX1001-VP-P 上海涞科 冰箱 BCD-215TDGA 海尔 垂直流超净工作台 ZHJH-C1214B 苏净集团安泰公司 多功能恒温搅拌器 HJ-5 雷伯尔（北京）公司 二氧化碳培养箱 HERA cell 150i 日本三洋公司 倒置显微镜 XSB-1 A 重庆光学电子有限公司 . 2.2 材料与试剂 RPMI-1640 培养基 美国 Life Technologies 公司 DMEM 培养基 美国 Life Technologies 公司 Penicillin 美国 Life Technologies 公司 streptomycin 美国 Life Technologies 公司 胎牛血清 美国 HyClone 公司甲醇 北京化工厂 乙醇 北京化工厂NaCl 北京化工厂 KCl 北京