拟南芥转录因子基因ABS5、ABS7和GTPase家族基因SVR10克隆与功能研究.docVIP

　　拟南芥转录因子基因ABS5、ABS7和GTPase家族基因SVR10克隆与功能研究 第一章 文献综述 1.1高等植物叶片的发育 高等植物的叶器官发育对于保证植物的正常生长起着重要的作用。在自然界中不同物种植物的叶片形态差别很大，即使同一棵植物在生长发育的不同时期，不同部位的叶片形态都可能存在巨大的差异。叶片的发育主要受自身的遗传因素和外界环境因素两方面的共同调控。本研究主要从分子遗传学的角度探究叶片形态发育的调控机理。目前的研究显示，叶的发育通常可以分为三个阶段：由顶端分生组织发育形成突起，形成幼叶（极性的建立）以及边缘分生组织的发育（如图 1-1）(Smith and Hake 1992)。在植物的顶端分生组织中央有一团处于非分化状态且具有持续分裂能力的无定形细胞,而在这个中心区周围的细胞分裂速度则明显加快并分化形成叶原基，紧接着叶细胞开始大量的分裂形成突起(Tsukaya 1995)。研究表明，拟南芥叶片的发育过程受到很多基因调控。例如在顶端分生组织的发育过程中，KNOX 家族基因活跃表达对于维持顶端分生组织的持续分裂能力起着关键作用，而在叶原基和发育中的叶片中原位杂交实验表明KNOX 处于沉默状态，表明 KNOX 基因特异的在叶发育的起始阶段发挥调控作用(Semiarti et al. 2001; Jackson et al. 1994)。伴随着叶细胞的持续分裂，植物建立叶极性，形成幼叶。叶极性的建立是叶片整个发育过程中最重要的阶段。在这个阶段，叶细胞从均一的细胞向特定的细胞类型分化，并形成在体轴上不对称的叶器官。成熟的叶片由三个不对称轴组成：近远轴、基顶轴和中边轴。叶片面对主茎的叶面称为近轴面，背对主茎的叶面称为远轴面，两个叶面之间的轴称为近远轴；叶柄基部到叶尖的轴称为基顶轴；叶脉中心至两侧的轴称为中边轴。而近远轴是基顶轴和中边轴发育的基础，只有当近远轴的极性建立之后叶片的不对称发育才会开始(Boan et al. 2002)。分离到的第一个与近远轴分化有关的突变体是金鱼草突变体 phantastica (phan)(YB 研究进展 转录因子是一大类具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子。转录因子在动物，植物中广泛存在，并在生长、发育、分化以及在对环境信号的响应等生物途径中，直接或者间接的与上游非编码区的顺式作用元件相结合起调控作用。根据 结合 DNA的序列特点将转录因子分为两类：通用转录因子和特异转录因子。通用转录因子如与起始 mRNA 合成有关的 RNA 酶等辅助因子，不具有基因特异性。后者，则是有选择，目的性的与特定基因的不同位点结合发挥转录激活或者转录抑制作用(Meshi and Iann and Ratcliffe 2000)。拟南芥中目前已发现的转录因子，大体可以分为如表1-2 中所列的几大类。 . 第二章 拟南芥叶形突变体 abs5-1D 和 abs7-1D 的分离 2.1 材料与方法 2.1.1 实验中用到的植物 野生型拟南芥（生态型 Col-0，Ler）由本实验室保存。abs5-1D，abs7-1D 由本实验室筛选得到，abs5-1(CS103877)，abs7-1(Salk_149918C)购于拟南芥种质资源中心 TheArabidopsis Information Resource 2.1.2 实验中用到的质粒，菌株 2.1.2.1 质粒： pBluescript 用于基因克隆；pBI111L 植物二元载体用于农杆菌转化；pGADT7，pGBKT7 用于酵母转录激活；pTF486 带 GFP 荧光标记，用于亚细胞定位；pET28a 用于蛋白表达。 .. 2.2叶形突变体 abs5-1D 的筛选 本实验通过筛选叶形发生变化的突变体材料来研究植物叶片的生长发育。abs5-1D是从拟南芥激活标签突变体库中筛选到的一株显性叶型突变体。abs5-1D突变体最显著的表型是叶片的边缘较野生型表现出向上卷曲的表型并且衰老的叶片较幼嫩叶片叶卷曲的程度更强。五周龄时，如图所示突变体abs5-1D叶片卷曲，皱缩明显，同时 抽薹以后着生的茎生叶也表现出强烈的卷曲表型（图 2-1A-B）。五周龄的突变体abs5-1D与野生型第八片叶经过石蜡包埋后从叶中部横切，清楚的观察到突变体叶上卷，而且突变体abs5-1D木质部较野生型更松散，并观察到更多的维管束细胞，但海绵组织和栅栏组织细胞未发现变化（图 2-1D-G）。此外，abs5-1D的次生花序相比野生型在数量方面增多，表现出在花序发育上的异常（表 2-1）。所以 abs5-1D突变引起了植物多器官发育的问题。由于突变体 abs5-1D 是在激活标签技术的背景下筛选到的，因此本实验需检测是否突变表型与 T-DNA 的筛选标记紧密连锁。Southern blot 检测