果胶酶基因之克隆显示及在寒羊瘤胃环境之多样性分析.docVIP

　　果胶酶基因之克隆显示及在寒羊瘤胃环境之多样性分析 第一章 绪论 1.1果胶类物质的组成和结构 纤维素是由脱水吡喃葡萄糖通过 beta;-1,4-糖苷键连接而形成的无侧链的具有复杂三级结构的多糖，其链间通过氢键、疏水作用和范德华力而形成微纤维(Percival et al., 2006)，在木本植物初生壁干物质中约占 30%；半纤维素是由五碳糖(木糖和阿拉伯糖)和六碳糖(主要是甘露糖，少量的葡萄糖和半乳糖)和糖醛酸形成的异源聚合物，主要存在于细胞表面，其组成因的不同而有所差异，其含量约占 30%(Saha, 2003)。果胶类物质主要存在于植物细胞壁的中胶层，其在植物细胞壁初生壁和次生壁中的含量较少(Brett T-easy 购自 Promega 公司；DNA 琼脂糖凝胶回收试剂盒(DP210)和 PCR 产物纯化试剂盒(DP204)、细菌和真菌基因组提取试剂盒(DP302，DP307)以及各种核酸分子量 Marker(1 kbPlus DNA Ladder 等)购自天根生化科技(北京)有限公司；实验所用各种 DNA 聚合酶购自 TakaRa公司；各种限制性内切酶和 T4DNA 连接酶购自 NEB 公司。酵母提取物和蛋白胨为 Oxford 公司产品。多聚半乳糖醛酸和各种甲酯化的果胶(P9311，DM: 34%；P9436，DM: 70%；P9561, DM: 85%)为 SIGMA 公司产品，其余化学试剂均为国产分析纯。 第三章 直接从瘤胃微生物中克隆果胶酶............... 57-78 3.1 实验材料............... 57 3.1.1 宏基因组 DNA............... 57 3.1.2 菌株，载体，工具酶，试剂............... 57 3.1.3 引物合成及 DNA 测序............... 57 3.1.4 常用溶液............... 57 3.1.5 培养基............... 57 3.1.6 主要仪器............... 57 3.2 实验方法 ...............57-63 3.2.1 目标基因序列的选择 ...............57-58 3.2.2 宏基因组中果胶酶全长序列的扩增............... 58-59 3.2.3 宏转录组中果胶酶基因的扩增............... 59-63 3.3 结果与分析............... 63-75 3.4 讨论............... 75-77 本章小结 ...............77-78 第四章 瘤胃中两个果胶酶基因的异源表达............... 78-88 4.1 实验材料............... 78-79 4.1.1 菌株和质粒 ...............78 4.1.2 引物合成及 DNA 测序...............78 4.1.3 试剂盒、工具酶和生化试剂............... 78 4.1.4 主要仪器 ...............78 4.1.5 培养基...............78 4.1.6 常用溶液............... 78-79 4.2 实验方法............... 79-83 4.3 结果与分析 ...............83-86 4.3.1 重组酶在大肠杆菌中的表达............... 83-84 4.3.2 重组酶酶学性质的测定............... 84-86 4.4 讨论............... 86-87 本章小结 ...............87-88 第五章 具有应用潜力的新颖果胶酶的克隆............... 88-137 1.1 实验材料............... 88-89 1.2 实验方法............... 89-100 结论 1. 从果胶酶的蛋白序列信息方面着手，根据 Pfam 的相关信息，首次设计了 5 套果胶酶的简并引物，并成功验证了这些引物的可行性。并以此为基础，发展建立起一套使用 PCR 的方法快速、有效的分析环境中果胶酶基因多样性的分子生物学技术。本文报道的利用果胶酶简并引物PCR 的方法分析瘤胃环境中多种果胶酶的多样性尚属首次。 2. 对小尾寒羊瘤胃环境的进食后不同时间点的果胶酶酶活进行评估，发现果胶酶在瘤胃环境中的酶活呈现先升后降的趋势，在 6 h 时达到酶活最高点。对绵羊瘤胃宏基因组 DNA 研究发现，瘤胃环境中存在非常丰富的果胶酶基因片段，绝大部分是未被报道过的新颖基因资源。5