猪源多能性基因之克隆与猪Oct4基因重编程功能研究.docVIP

　　猪源多能性基因之克隆与猪Oct4基因重编程功能研究 1前言 1.1多能性基因概述 个体发育是一个不可逆的细胞发育潜能逐渐受限的过程。如同一颗斜坡上向下滚落的弹珠可停留于不同高度而具有不同的势能(C. H. P(bonemor phogeic proteins)的无血清培养条件下持续扩增。Nanog基因敲除小鼠在着床后很快死亡(胚胎发育5.5d左右)。进一步研究表明，Nanog缺失导致囊胚中的内细胞团不能继续发育成上胚层，而仅仅产生结构异常的胚外组织。Nanog缺失的ES细胞丧失多能性，分化成胚外内胚层细胞(extraem bryonicendoderm cell)。在人ES细胞当中，过表达Nanog可以使细胞在无伺养层的条件下保持多能性传代。 2材料与方法 2.1实验材料 猪卵巢取自于哈尔滨市大众肉联集团有限公司。新生长白猪耳组织取自哈尔滨市三元猪场。精液取自哈尔滨市三元猪场。 2.1.2主要仪器与设备 DGG-9140B型电热恒温鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司；PCR仪，美国PE公司；梯度PCR仪，德国Biometro公司；DK-8D型电热恒温水槽，上海一恒科技有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅，日本；二氧化碳培养箱，美国Thermo Electron集团；ADZUCORPORZTION，日本；高速冷冻离心机，美国Beckman公司；Pall超纯水系统，美国PALL-GELMAN公司；恒温摇床，中国科学院武汉科学制造厂；凝胶成像系统，美国UVP公司；DRP-9162型电热恒温培养箱，上海森信实验仪器有限公司；KQ-500DV型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；-7(rC低温冰箱，日本SANYO公司；微量移液器，法国GILSON公司；DFPLAP0IX-4实体解剖镜，OLYMPUS日本；CX2I倒置显微镜，OLYMPUS曰本；紫外分光光度计，美国Phamacia公司；焚光显微镜，Leica-DF280德国；实时劳光定量PCR仪，ABI7500;倒置显微镜：TS-100尼康日本； 3 结果与分析........... 51-93 3.1. 猪源多能基因的克隆与分析鉴定........... 51-84 3.1.1 猪Oct4基因的克隆与生物........... 51-55 3.1.2 猪Sox2基因的克隆与生........... 55-60 3.1.3 猪Klf4基因的克隆与生物........... 60-65 3.1.4 猪c-Myc基因的克隆与生........... 65-70 3.1.5 猪Nanog基因的克隆与生...........70-75 3.1.6 猪Nr5a2基因的克隆与...........75-80 3.1.7 猪Tcll基因的克隆........... 80-82 3.1.8 猪Eras基因的克隆...........82-84 3.2 猪Oct4基因重编程功能的研究........... 84-93 4 讨论 ...........-99 4.1 克隆猪多能性基因模板的选择........... 93 4.2 猪Nr5a2基因的克隆及表达分析........... 93-94 4.3 猪多能基因结构分析........... 94 4.4 猪Oct4基因的克隆及序列分析........... 94 4.5 猪Oct4基因过表达逆转录病毒........... 94-95 4.6 猪Oct4基因激活多能基因的表达分析 ...........95 4.7 猪Oct4基因主要通过缩短G........... 95-96 4.8 猪Oct4基因对表观遗传修饰基因的影响...........96-97 4.9 猪Oct4基因对细胞连接的影响........... 97-99 5 结论........... 99-100 结论 建立完全重编程的猪诱导多能性干细胞对转基因动物研究和应用都具有重要意义。目前获得的猪诱导多能性干细胞采用的诱导基因都来自于小鼠和人而非猪本源，可能是目前无法获得具有产生嵌合体能力的猪诱导多能性干细胞的重要原因之一。最重要的诱导多能性基因Oct4虽然在多能性维持的机制上研究较为充分，但在诱导多能性干细胞中的重编程功能还鲜有研究。本论文克隆得到了八种猪源多能性基因并进行了物种间同源性和结构差异性分析，另将克隆得到的猪Oct4基因过表达于猪成纤维细胞中，研究了猪Oct4基因在多能性基因的激活、细胞周期、细胞连接和细胞表观遗传学标记重建等重要重编程机制中的作用。获得结论如下： (1)本实验克隆了8种猪多能性基因，包括Oct4，Sox2, Klf4，c-Myc, Nanog，Tell, Ems和Nr5a2,，其中首次获得了猪基因的两种转录变异体